Olverembatinib (GZD824) dimesylate Bcr-Abl inibitore

GZD824 inibisce potentemente la crescita delle cellule Ba/F3 che esprimono Bcr-Abl wildtype con IC50 di 1,0 nM. Altamente coerente con l'inibizione biochimica della chinasi e l'elevata affinità di legame proteico, GZD824 inibisce anche fortemente la proliferazione delle cellule Ba/F3 che esprimono il mutante Bcr-AblT315I e altri 14 mutanti Bcr-Abl rilevanti per la resistenza. Inoltre, GZD824 sopprime efficacemente l'attivazione di Bcr-Abl così come di Crkl e STAT5 a valle in modo concentrazione-dipendente nelle cellule K562 CML. [1]

Saggio Z′-Lyte basato su FRET per la rilevazione della fosforilazione del substrato peptidico

Le chinasi ABL1, ABL1(E255K), ABL1 (G250E), ABL1(T315I) e ABL1(Y253F) sono P3049, PV3864, PV3865, PV3866 e PV3863 sono proteine ricombinanti umane a lunghezza intera espresse in cellule di insetto e marcate con istidina. Le attività di inibizione degli inibitori contro Abl1 e i suoi mutanti vengono eseguite in piastre a 384 pozzetti utilizzando il sistema di saggio Z′-Lyte basato su FRET. Brevemente, il substrato della chinasi viene diluito in 5 μL di tampone di reazione della chinasi; e la chinasi viene aggiunta. I composti (10 nL) con le concentrazioni indicate vengono quindi consegnati alla reazione utilizzando un manipolatore di liquidi Echo, e la miscela viene incubata per 30 min a temperatura ambiente. Quindi vengono aggiunti 5 μL di soluzione di ATP 2X per iniziare la reazione, e la miscela viene ulteriormente incubata per 2 ore a temperatura ambiente. Le reazioni risultanti contengono 10 μM (per Abl1 wild-type e mutanti Y253F, Q252H, M351T e H396P) o 5 μM (per mutanti E255K, G250E, T315I) di ATP, 2 μM di substrato peptidico Tyr2 in 50 mM HEPES (PH 7.5), 0,01% BRIJ-35, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,0247 μg/mL Abl1 e inibitori, se appropriato. Quindi, vengono aggiunti 5 μL di reagente di sviluppo, e la miscela viene incubata per 2 ore a temperatura ambiente prima di aggiungere 5 μL di soluzione di arresto. Il rapporto del segnale di fluorescenza di 445 nm (cumarina)/520 nm (fluoresceina) viene esaminato su un lettore multietichetta EnVision. I dati vengono analizzati utilizzando Graphpad Prism5. I dati sono il valore medio di tre esperimenti.

GZD824, a dosi di 5 e 10 mg/kg/die, inibisce in modo dose-dipendente la crescita tumorale nel xenotrapianto tumorale K562 e nel modello di xenotrapianto Ku812 senza mortalità o significativa perdita di peso corporeo. Inoltre, GZD824 (20 mg/kg/die) sopprime la crescita tumorale nei topi portatori di cellule Ba/F3 alloinnestate che esprimono Bcr-AblWT e Bcr-AblT315I. [1]