Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl inibitore

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) mostra potenti attività inibitorie contro Abl1 nativo purificato in forme non fosforilate (u-Abl1^native) e fosforilate (p-Abl1^native), Abl1^T315I mutante del gatekeeper non fosforilato e fosforilato, e il mutante del loop di attivazione Abl1^H396P in modo non ATP-competitivo con valori di IC50 di 0,8 nM, 2 nM, 1,4 nM, 5 nM e 4 nM, rispettivamente. Inoltre, inibisce anche le chinasi della famiglia Src Src, LYN, FGR e HCK, e le TK del recettore KDR, FLT3 e TIE2 con valori di IC50 di 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM e 6 nM, rispettivamente. [1] Questo composto mostra attività antiproliferative contro le cellule Ba/F3 che esprimono Bcr-Abl1 nativo o mutante con IC50 che vanno da 2 nM a 150 nM. Inoltre, inibisce anche la proliferazione della linea cellulare Ph⁺ K562 (IC50 5,5 nM) e induce potentemente l'apoptosi sia nelle cellule Ba/F3 che K562 che esprimono Bcr-Abl1. [1] Uno studio recente mostra che esso esibisce selettività per l'inibizione della crescita delle cellule Bcr-Abl-positive mediante la sua marcata inibizione delle linee cellulari CML rispetto alle linee leucemiche non CML. [2]

Saggio delle isoforme chinasiche di Abl1 e determinazione della potenza dell'inibitore

L'attività di u-Abl1native è determinata seguendo la produzione di ADP dalla reazione chinasica tramite accoppiamento con il sistema piruvato chinasi/lattato deidrogenasi. In questo saggio, l'ossidazione del NADH (misurata come una diminuzione di A340nm) viene monitorata continuamente spettrofotometricamente. La miscela di reazione finale (100 μL, in una piastra Corning a 384 pozzetti) viene preparata come segue: Una miscela di componenti del saggio accoppiato/chinasi Abl1 viene preparata contenente u-Abl1 chinasi (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), piruvato chinasi (~ 4 unità), lattato deidrogenasi (~ 0,7 unità), fosfoenolpiruvato (1 mM) e NADH (0,28 mM) in 90 mM Tris contenente 0,1 % di ottil-glucoside e 1 % di DMSO, pH 7,5. Separatamente, viene preparata una miscela di inibitore contenente Rebastinib (DCC-2036) diluito in serie 3 volte in DMSO, seguita da diluizione in un tampone composto da 180 mM Tris, pH 7,5, contenente MgCl₂ (18 mM) e 0,2 % di ottil-glucoside. Cinquanta μL della miscela di inibitore vengono mescolati con 50 μL della suddetta miscela di componenti del saggio accoppiato/chinasi Abl1, che viene quindi incubata a 30 °C per 2 ore prima che vengano aggiunti 2 μL di ATP 25 mM (500 μM, finale) per avviare la reazione. La reazione viene registrata ogni 2 minuti per 2,5 ore a 30 °C su un lettore di piastre Polarstar Optima o Synergy2. La velocità di reazione (pendenza) viene calcolata utilizzando l'intervallo di tempo da 1 a 2 ore con il software del lettore. La percentuale di inibizione si ottiene confrontando la velocità di reazione con quella di un controllo DMSO. I valori di IC50 vengono calcolati da una serie di valori di percentuale di inibizione determinati a un intervallo di concentrazioni di inibitore utilizzando GraphPad Prism. Il saggio chinasico per Abl1T315I, p-Abl1native o Abl1H396P viene saggiato allo stesso modo di cui sopra, eccetto che vengono utilizzati 2,2 nM di Abl1T315I, 1 nM di p-Abl1 nativa o 1,3 nM di Abl1H396P. Il formato di saggio di cui sopra viene utilizzato anche per chinasi diverse da Abl1 con l'eccezione di TIE2, per il quale viene utilizzato un formato di polarizzazione della fluorescenza/Transcreener. Le condizioni del saggio sono le stesse descritte sopra, eccetto che PolyE4Y (1 mg/mL finale) viene utilizzato come substrato e viene utilizzata una preincubazione di un'ora.

In un modello di allotrapianto murino che porta cellule leucemiche Ba/F3-Bcr-Abl1T315I, il trattamento con Rebastinib (DCC-2036) per via orale a 100 mg/kg una volta al giorno inibisce efficacemente la segnalazione di Bcr-Abl1 e prolunga significativamente la sopravvivenza dei topi. [1]