Rebastinib (DCC-2036) Bcr-Abl Inibitore

A conformational control inhibitor of Abl1 and T315I Abl1.

Rebastinib (DCC-2036) shows potent inhibitory activities against purified native Abl1 in unphosphorylated (u-Abl1^native) and phosphorylated (p-Abl1^native) forms, unphosphorylated and phosphorylated gatekeeper mutant Abl1^T315I, and the activation loop mutant Abl1^H396P in a non-ATP-competitive manner with IC50 values of 0.8 nM, 2 nM, 1.4 nM, 5 nM, and 4 nM, respectively. Moreover, it also inhibits the Src family kinases Src, LYN, FGR, and HCK, and the receptor TKs KDR, FLT3, and TIE2 with IC50 values of 34 nM, 29 nM, 38 nM, 40 nM, 4 nM, 2 nM and 6 nM, respectively. [1] This compound shows anti-proliferative activities against Ba/F3 cells expressing native or mutant Bcr-Abl1 with IC50 ranging from 2 nM to 150 nM. In addition, it also inhibits proliferation of the Ph⁺ cell line K562 (IC50 5.5 nM), and induces apoptosis in both Bcr-Abl1-expressing Ba/F3 and K562 cells potently. [1] A recent study shows that it exhibits selectivity for growth inhibition of Bcr-Abl-positive cells by its marked inhibition of CML cell lines compared to non-CML leukemia lines. [2]

Saggio delle isoforme chinasiche di Abl1 e determinazione della potenza dell'inibitore

L'attività di u-Abl1native è determinata seguendo la produzione di ADP dalla reazione chinasica tramite accoppiamento con il sistema piruvato chinasi/lattato deidrogenasi. In questo saggio, l'ossidazione del NADH (misurata come una diminuzione di A340nm) viene monitorata continuamente spettrofotometricamente. La miscela di reazione finale (100 μL, in una piastra Corning a 384 pozzetti) viene preparata come segue: Una miscela di componenti del saggio accoppiato/chinasi Abl1 viene preparata contenente u-Abl1 chinasi (1 nM), Abltide (EAIYAAPFAKKK, 0,2 mM), MgCl₂ (9 mM), piruvato chinasi (~ 4 unità), lattato deidrogenasi (~ 0,7 unità), fosfoenolpiruvato (1 mM) e NADH (0,28 mM) in 90 mM Tris contenente 0,1 % di ottil-glucoside e 1 % di DMSO, pH 7,5. Separatamente, viene preparata una miscela di inibitore contenente Rebastinib (DCC-2036) diluito in serie 3 volte in DMSO, seguita da diluizione in un tampone composto da 180 mM Tris, pH 7,5, contenente MgCl₂ (18 mM) e 0,2 % di ottil-glucoside. Cinquanta μL della miscela di inibitore vengono mescolati con 50 μL della suddetta miscela di componenti del saggio accoppiato/chinasi Abl1, che viene quindi incubata a 30 °C per 2 ore prima che vengano aggiunti 2 μL di ATP 25 mM (500 μM, finale) per avviare la reazione. La reazione viene registrata ogni 2 minuti per 2,5 ore a 30 °C su un lettore di piastre Polarstar Optima o Synergy2. La velocità di reazione (pendenza) viene calcolata utilizzando l'intervallo di tempo da 1 a 2 ore con il software del lettore. La percentuale di inibizione si ottiene confrontando la velocità di reazione con quella di un controllo DMSO. I valori di IC50 vengono calcolati da una serie di valori di percentuale di inibizione determinati a un intervallo di concentrazioni di inibitore utilizzando GraphPad Prism. Il saggio chinasico per Abl1T315I, p-Abl1native o Abl1H396P viene saggiato allo stesso modo di cui sopra, eccetto che vengono utilizzati 2,2 nM di Abl1T315I, 1 nM di p-Abl1 nativa o 1,3 nM di Abl1H396P. Il formato di saggio di cui sopra viene utilizzato anche per chinasi diverse da Abl1 con l'eccezione di TIE2, per il quale viene utilizzato un formato di polarizzazione della fluorescenza/Transcreener. Le condizioni del saggio sono le stesse descritte sopra, eccetto che PolyE4Y (1 mg/mL finale) viene utilizzato come substrato e viene utilizzata una preincubazione di un'ora.

In a mouse allograft model bearing Ba/F3-Bcr-Abl1T315I leukemia cells, treatment with Rebastinib (DCC-2036) by oral gavage at 100 mg/kg once daily effectively inhibits Bcr-Abl1 signaling and significantly prolongs mouse survival. [1]