KW-2449 FLT3 inibitore

Investigated as a FLT3 inhibitor in clinical trials, with others in early development.

KW-2449, un inibitore multichinasico di FLT3, ABL, ABL-T315I e Aurora kinase, è sotto indagine per il trattamento di pazienti affetti da leucemia. Questo composto mostra potenti effetti inibitori della crescita sulle cellule leucemiche con mutazioni FLT3 mediante l'inibizione della FLT3 chinasi, con conseguente down-regulation di FLT3/STAT5 fosforilato, arresto in G1 e apoptosi. La somministrazione orale di questa sostanza chimica mostra un'inibizione dose-dipendente e significativa della crescita tumorale nel modello di xenotrapianto con mutazione FLT3 con minima soppressione del midollo osseo. Nella leucemia umana con FLT3 wild-type, induce la riduzione dell'istone H3 fosforilato, l'arresto in G2/M e l'apoptosi. Nella leucemia resistente all'Imatinib, questo agente contribuisce a superare la resistenza mediante la simultanea down-regulation di BCR/ABL e Aurora kinases. L'attività inibitoria di questo composto non è influenzata dalla presenza di proteine plasmatiche umane, come l'α1-glicoproteina acida. Possiede una potente attività inibitoria della crescita contro vari tipi di leucemia tramite diversi meccanismi d'azione. Questo inibitore ha un'attività significativa e giustifica uno studio clinico in pazienti affetti da leucemia con mutazioni FLT3 e mutazioni resistenti all'Imatinib. I livelli di fosforilazione di FLT3 e STAT5 sono diminuiti da questa sostanza chimica in modo dose-dipendente. Inoltre, inibisce potentemente ABL-T315I, che è associato alla resistenza all'IM, con un IC50 di 4 nM. D'altra parte, questo composto ha scarso effetto su PDGFRβ, IGF-1R, EGFR e varie serina/treonina chinasi anche a una concentrazione di 1 μM. Ha potenti attività inibitorie della crescita non solo contro le cellule leucemiche che esprimono FLT3/ITD, ma anche contro le cellule leucemiche attivate da FLT3/KDM e le cellule leucemiche che sovraesprimono FLT3 wild-type. In accordo con l'effetto inibitorio della crescita, questo agente sopprime le fosforilazioni di FLT3 (P-FLT3) e della sua molecola a valle fosfo-STAT5 (P-STAT5) nelle cellule MOLM-13 in modo dose-dipendente. Inoltre, aumenta la percentuale di cellule in fase G1 del ciclo cellulare e riduce reciprocamente la percentuale di cellule in fase S, con conseguente aumento della popolazione di cellule apoptotiche. Questo composto può defosforilare la chinasi WT-FLT3 costitutivamente attiva, ma non inibisce la proliferazione delle cellule leucemiche se non sono principalmente dipendenti dalla chinasi FLT3. [1] Viene rapidamente assorbito e convertito in un metabolita principale M1. Studi preclinici rivelano che questa sostanza chimica viene convertita dalla monoaminossidasi-B (MAO-B) e dall'aldeide ossidasi nel suo metabolita principale M1. Questo agente media la citotossicità tramite l'inibizione di FLT3/ITD. È un inibitore diretto di FLT3 e induce l'inibizione del suo bersaglio a valle STAT5. [2] Questo composto interagisce sinergicamente con gli HDACI per indurre apoptosi nelle cellule CML Ph+ in modo tempo- e concentrazione-dipendente. Migliora sinergicamente la letalità di vorinostat/SNDX275 nelle cellule CML. Questi regimi di inibitori sono attivi contro ulteriori cellule leucemiche Bcr/Abl⁺ resistenti all'IM. Riduce moderatamente la fosforilazione dell'istone H3, un indicatore dell'attività di Aurora B, nelle cellule K562 trattate con nocodazolo. [3]

Fosforilazione di FLT3

Le cellule leucemiche vengono lavate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), quindi lisate risospendendo le cellule in tampone di lisi (20 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% Igepal, 1 mM EDTA, 2 mM NaVO₄, più inibitore completo delle proteasi KW-2449 per 30 minuti sotto agitazione. L'estratto viene chiarificato mediante centrifugazione a 1.6 × 10⁴ g e il surnatante viene analizzato per le proteine (Bio-Rad). Un'aliquota di 50 μg viene rimossa come lisato cellulare intero per l'analisi di STAT5, e il rimanente viene utilizzato per l'immunoprecipitazione con anti-FLT3. L'anticorpo anti-FLT3 viene aggiunto all'estratto per un'incubazione notturna, quindi la sefarosio proteina A viene aggiunta per altre 2 ore. Gel di elettroforesi su gel di poliacrilammide-dodecil solfato di sodio (SDS-PAGE) separati per il lisato cellulare intero e gli immunoprecipitati vengono eseguiti in parallelo. Dopo il trasferimento su membrane Immobilon, l'immunoblotting viene eseguito con anticorpo anti-fosfotirosina (4G10) per rilevare FLT3 fosforilato o, per i gel di lisato cellulare intero, con un anticorpo monoclonale di ratto contro STAT5 fosforilato (residuo Y694) quindi strippato e riprobato con anticorpo anti-FLT3 per misurare il FLT3 totale. Le proteine vengono visualizzate utilizzando la chemiluminescenza, esposte su film Kodak BioMax XAR, sviluppate e scansionate utilizzando un densitometro Bio-Rad GS800. La concentrazione di questo composto per la quale la fosforilazione di FLT3 o STAT5 è inibita al 50% della sua linea di base (IC50) viene determinata utilizzando l'analisi di regressione lineare delle curve dose-risposta. Per l'analisi diretta di FLT3 e STAT5 in blasti circolanti, il sangue periferico viene raccolto in provette eparinate e prontamente raffreddato su ghiaccio. I campioni vengono centrifugati per 10 minuti a 900 g, a 4 °C. Il plasma viene rimosso e conservato congelato a –80 °C. Il buffy coat viene accuratamente trasferito in PBS ghiacciato, stratificato su Ficoll-Hypaque refrigerato e centrifugato per 5 minuti a 600 g, a 4 °C. Tutte le fasi successive vengono eseguite a 4 °C. Le cellule mononucleate vengono raccolte e lavate rapidamente una volta in tampone di lisi dei globuli rossi (0.155 M NH₄Cl, 0.01 M KHCO₃, 0.1 mM EDTA), quindi lavate una volta in PBS. Le cellule vengono quindi lisate come descritto per l'analisi di FLT3 e STAT5.

Nel modello di xenotrapianto tumorale MOLM-13, la somministrazione orale di KW-2449 per 14 giorni mostra un potente e significativo effetto antitumorale in modo dose-dipendente. [1]