NVP-BVU972 c-Met inibitore

NVP-BVU972 inibisce potentemente la chinasi MET ma mostra una bassa inibizione contro altre chinasi, inclusa la chinasi RON più strettamente correlata, con valori di IC50 superiori a 1000 nM. Questo composto sopprime anche la fosforilazione costitutiva di MET nelle cellule GTL-16 o la fosforilazione di MET stimolata da HGF nelle cellule A549 con valori di IC50 di 7,3 nM e 22 nM, rispettivamente. Previene potentemente la crescita delle linee cellulari GTL-16, MKN-45 ed EBC-1 amplificate dal gene MET con valori di IC50 di 66 nM, 82 nM e 32 nM, rispettivamente. In linea con la loro alta frequenza in questo screening di composti, le mutazioni Y1230 e D1228 danno luogo a spostamenti drammatici nei valori di IC50 misurati per esso nella linea cellulare BaF3. La resistenza innescata da V1155L è più limitata a questa sostanza chimica. Una riduzione dose-dipendente della fosforilazione di TPR-MET quando applicata a cellule BaF3 che esprimono TPR-MET wild-type. Sia le mutazioni Y1230H che D1228A hanno abrogato l'effetto di questo composto ma non di AMG 458. Tuttavia, F1200I e L1195V interferiscono con la sua potenza nel prevenire la fosforilazione di TPR-MET.[1]

Saggio biochimico TR-FRET con MET wild type e mutanti

L'attività enzimatica viene misurata in un saggio di trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza risolto nel tempo (TR-FRET), rilevando la fosforilazione della tirosina con un anticorpo anti-fosfo-tirosina marcato con Eu (donatore di fluorescenza) e alloficocianina coniugata a streptavidina (accettore di fluorescenza) che si lega a una biotina sul peptide substrato. Per ogni variante, le concentrazioni di K_m per ATP vengono determinate in assenza di questo composto, e la concentrazione di ATP nella reazione chinasica viene impostata a K_m (4 μM per MET wt, 1 μM per MET Y1230H e MET F1200I). Viene disciolto e diluito in DMSO e saggiato in quadruplicato. Le reazioni chinasiche vengono eseguite in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4 mM MnCl₂, 0,05% Tween 20, 0,05% albumina sierica bovina, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 mM Na₃VO₄, in piastre bianche da 1536 pozzetti a temperatura ambiente. Questo composto chimico e l'enzima vengono incubati in un volume di 2 μL per 20 min, seguiti dall'aggiunta di 1 μL di ATP e 1 μL di peptide substrato biotinilato (PTK1) a concentrazioni finali rispettivamente di K_m e 1 μM. Le concentrazioni enzimatiche nelle reazioni sono 5 nM per MET wt e 4 nM per le varianti F1200I e Y1230H. Dopo 90 min, le reazioni vengono interrotte con l'aggiunta di 1 μL di soluzione di stop/rilevazione per raggiungere concentrazioni finali di 10 mM EDTA, 3,5 nM di anticorpo anti-fosfo-tirosina marcato con Eu PY20 e 10 nM di streptavidina alloficocianina. Il trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza risolto nel tempo viene misurato in un lettore di piastre Envision (eccitazione 320 nm, emissione 615 nm e 665 nm).