Golvatinib (E7050) c-Met inibitore

Studi in vitro indicano che Golvatinib (E7050) inibisce potentemente la fosforilazione sia di c-Met che di VEGFR-2. Reprime inoltre potentemente la crescita sia delle cellule tumorali amplificate in c-Met che delle cellule endoteliali stimolate con HGF o VEGF. [1] Questo composto aggira la resistenza a tutti gli EGFR-TKI reversibili, irreversibili e selettivi per i mutanti indotta da HGF esogeno e/o endogeno nelle linee cellulari di cancro al polmone con mutazione EGFR, bloccando la via Met/Gab1/PI3K/Akt in vitro. Previene inoltre l'emergere di cellule HCC827 resistenti al gefitinib indotte da esposizione continua a HGF. [2]

Analisi Western blot

Lo stato di fosforilazione di c-Met e VEGFR-2 viene rilevato mediante analisi Western blot. Per c-Met, le cellule MKN45 vengono incubate con una diluizione seriale di Golvatinib (E7050) in terreno completo a 37 °C per 2 h. Per VEGFR-2, le HUVEC vengono private di siero con terreno privo di siero endoteliale umano contenente lo 0,5% di FBS per 24 h. Successivamente le HUVEC vengono incubate con una diluzione seriale di questo composto per 1 h e quindi incubate con 20 ng/mL di VEGF umano per 5 min. Le cellule vengono lisate con tampone di lisi (50 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Triton X-100, 1.5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA [pH 8.0], 100 mM NaF, 1 mM fenilmetilsulfonilfluoruro, 1 mM ortovanadato di sodio, 10 μg/mL aprotinina, 50 μg/mL leupeptina e 1 μg/mL pepstatina A). I campioni tumorali resecati vengono omogeneizzati con tampone di lisi contenente 25 mM β-glicerofosfato e 0.5% (v/v) di cocktail inibitore della fosfatasi 2 a 4 °C. I detriti cellulari vengono rimossi mediante centrifugazione a 17 860g per 20 min a 4 °C. Aliquote dei surnatanti contenenti 5-20 μg di proteina vengono sottoposte a SDS-PAGE in condizioni riducenti. Le proteine vengono quindi trasferite su membrane PVDF, bloccate con TBS contenente 0.05% Tween-20 e 5% latte scremato o 5% BSA. Le membrane vengono sondate con i seguenti anticorpi: anticorpo policlonale anti-c-Met (C-28) e anticorpo policlonale anti-VEGFR-2 (C-20); anticorpo monoclonale anti-fosfotirosina clone 4G10; e anticorpo policlonale anti-VEGFR-2, anticorpo policlonale anti-fosfo-VEGFR-2 (Tyr996) e anticorpo policlonale anti-fosfo-c-Met (Tyr1234/1235). La rilevazione viene eseguita utilizzando un kit di chemiluminescenza potenziata Super Signal. Le bande immunoreattive vengono visualizzate mediante chemiluminescenza con un sistema di rilevamento Image Master-VDS-CL. L'intensità di ciascuna banda viene misurata utilizzando un analizzatore di immagini.

Golvatinib (E7050) mostra l'inibizione della fosforilazione di c-Met e VEGFR-2 nei tumori in vivo, con una forte soppressione della crescita tumorale e dell'angiogenesi nei modelli di xenotrapianto. Il trattamento di alcune linee tumorali contenenti amplificazioni di c-Met con alte dosi di questo composto (50-200 mg/kg) induce regressione e scomparsa del tumore. In un modello di disseminazione peritoneale, dimostra un effetto antitumorale contro i tumori peritoneali e un significativo prolungamento della durata della vita nei topi trattati. [1] In un altro studio di xenotrapianto, i tumori prodotti da cellule Ma-1 trasfettate con HGF (Ma-1/HGF) sono più angiogenici rispetto ai tumori di controllo del vettore e mostrano resistenza a ZD1839. E7050 da solo inibisce l'angiogenesi e ritarda la crescita dei tumori Ma-1/HGF, e quando combinato con ZD1839, induce una marcata regressione della crescita tumorale. [3]