(R)-(-)-Gossypol (AT-101) acetic acid Bcl-2 inibitore

L'AT-101 inibisce un pannello di diverse neoplasie linfoproliferative con IC50 comprese tra 1,2 μM e 7,4 μM. L'AT-101 (10 μM) interrompe il Δψm in modo concentrazione- e tempo-dipendente in linee di linfoma diffuso a grandi cellule B e di linfoma a cellule del mantello. L'AT-101 (1 μM o 2 μM) combinato con carfilzomib (6 nM o 10 nM) induce l'apoptosi nelle linee cellulari HBL-2 e Granta. [2] L'AT-101 (20 μM per 24 ore) determina una mediana del 72% di apoptosi e una down-regulation di Mcl-1 nei linfociti CLL sia in coltura in sospensione che in co-coltura stromale. Le cellule stromali esprimono livelli non rilevabili di antiapoptotici ma alti livelli di proteine ERK e AKT attivate e presentano poca o nessuna apoptosi con AT-101. [3] L'AT-101 induce l'apoptosi in modo tempo- e dose-dipendente, con valori di ED50 di 1,9 mM e 2,4 mM rispettivamente nelle cellule Jurkat T e U937. L'AT-101 (10 μM) combinato con radiazioni (32 Gy) induce più apoptosi rispetto alle radiazioni da sole e supera la somma degli effetti causati dai trattamenti con singolo agente. L'AT-101 attiva SAPK/JNK in modo dose- e tempo-dipendente. [4] L'AT-101 (10 µM) induce l'apoptosi attraverso l'attivazione di caspasi-9, -3 e -7 nelle cellule VCaP. L'AT-101 (10 µM) diminuisce l'espressione di Bcl-2 e Mcl-1 nelle cellule VCaP. [5] L'AT-101 (< 20 μM) è in grado di inibire la crescita delle cellule di mieloma multiplo nonostante gli effetti di crescita stimolatori forniti dalle cellule stromali nell'ambiente del midollo osseo. L'AT-101 (10 μM) induce l'apoptosi nelle cellule di mieloma multiplo tramite l'attivazione delle caspasi 3, delle caspasi 9 e della PARP. L'AT-101 (10 μM) promuove l'apoptosi nelle cellule di mieloma multiplo interrompendo il rapporto Bax/Bcl-2 e il potenziale della membrana mitocondriale. [6]

Saggio di legame basato sulla polarizzazione della fluorescenza

Per esperimenti di legame competitivo, la proteina Bcl-2 (40 nM) e il peptide FAM-Bid (2,5 nM) vengono preincubati nel tampone di saggio (100 mM fosfato di potassio, pH 7,5; 100 μg/mL gamma globulina bovina; 0,02% sodio azide). 5 μL di una soluzione in DMSO di AT101 vengono aggiunti alla soluzione Bcl-2/FAM-Bid in piastre Dynex a 96 pozzetti, nere, a fondo tondo per produrre un volume finale di 125 μL. Per ogni esperimento, un controllo contenente Bcl-2 e peptide Flu-Bid (equivalente a 0% di inibizione), e un altro controllo contenente solo FAM-Bid, sono inclusi in ogni piastra di saggio. Dopo 4 ore di incubazione, i valori di polarizzazione in unità di millipolarizzazione (mP) sono stati misurati a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm utilizzando il lettore di piastre Ultra. L'IC50, la concentrazione dell'inibitore alla quale il 50% del peptide legato viene spostato, è determinata dal grafico utilizzando l'analisi dei minimi quadrati non lineare e l'adattamento della curva eseguito utilizzando il software GraphPad Prizm 4. Il peptide Bid BH3 non marcato viene utilizzato come controllo positivo. PF per la proteina Bcl-xL, peptide Bak BH3 marcato con 6-carbossifluoresceina estere succinimidico (FAM-Bak) anziché FAM-Bim per massimizzare il segnale. Si determina che FAM-Bak ha una Kd di 6 nM per la proteina Bcl-xL. Il saggio di legame competitivo per Bcl-xL è lo stesso di quello per Bcl-2 con le seguenti eccezioni: 30 nM di proteina Bcl-xL e 2,5 nM di peptide FAM-Bak nel seguente tampone di saggio: 50 mM Tris-Bis, pH 7,4 e 0,01% di gamma globulina bovina. PF per la proteina Mcl-1, il peptide FAM-Bid e la proteina Mcl-1 umana vengono utilizzati. Si determina che il peptide FAM-Bid si lega alla proteina Mcl-1 umana con una Kd di 1,71 nM. I saggi di legame competitivo per Mcl-1 vengono eseguiti allo stesso modo di quelli per Bcl-2 con le seguenti eccezioni: 5 nM di Mcl-1 e 1 nM di peptide Flu-Bid nel seguente tampone di saggio: 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl e 0,05% di acido Pluronic.

L'AT-101 è ancora rilevabile nel plasma con concentrazioni medie di 0,49 μM per il gruppo da 35 mg/kg e 0,39 μM per il gruppo da 200 mg/kg in topi SCID beige portatori di xenotrapianto RL-DLBCL. La concentrazione plasmatica di picco di AT-101 è osservata dopo 30 minuti dall'amministrazione del farmaco in entrambi i livelli di dose, con il gruppo da 200 mg/kg che mostra una concentrazione plasmatica media quasi 4 volte superiore a quella del gruppo da 35 mg/kg (7,88 μM e 27,78 μM rispettivamente) in topi SCID beige. L'AT-101 (da 25 mg/kg a 100 mg/kg, per via orale) porta indefinitamente a un'insorgenza precoce di perdita di peso equivalente a più del 10% del peso pre-trattamento e alla morte in topi SCID beige. L'AT-101 (35 mg/kg, per via orale al giorno per 10 giorni) più ciclofosfamide intraperitoneale (Cy) e rituximab intraperitoneale (R) mostrano un controllo significativo del volume tumorale rispetto a qualsiasi altro gruppo di trattamento. [2] L'AT-101 (15 mg/kg, p.o., 5 giorni/settimana) come singolo agente in topi intatti riduce significativamente lo sviluppo della crescita tumorale VCaP rispetto ai tumori non trattati alle settimane 2-6. L'AT-101 in combinazione con la castrazione chirurgica ritarda l'insorgenza della crescita tumorale VCaP andro-indipendente rispetto ai gruppi solo castrazione o solo AT-101 nei topi. [5]