SU9516 CDK inibitore

SU9516 diminuisce la fosforilazione cdk2-specifica della proteina pRB del retinoblastoma, aumenta l'attivazione della caspasi-3 e altera il Cell Cycle nelle cellule RKO e SW480. Questo composto inibisce anche la proliferazione cellulare e induce l'apoptosi cellulare in entrambe le linee cellulari. [1] Uccide le cellule leucemiche attraverso l'inibizione della fosforilazione della RNA Pol II CTD, il danno ossidativo e la down-regulation trascrizionale di Mcl-1. [2] Nelle cellule Jurkat di leucemia a cellule T umane, questa sostanza chimica aumenta significativamente la sensibilità al metotrexato. [3] Inoltre, sopprime anche la localizzazione centrosomale di Aurora-A e la conseguente amplificazione del centrosoma. [4]

Saggio di chinasi CDK

I saggi chinasici vengono eseguiti in piastre di polipropilene a 96 pozzetti. Ogni reazione conteneva 2 μg di istone H1 a una concentrazione finale di 10 μM [γ-³³P]ATP (0,2 μCi/pozzetto; circa il doppio del Km determinato sperimentalmente), 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% Triton X-100 e 10% glicerolo in un volume di 40 μL. La reazione viene avviata con l'aggiunta di 20 μL di enzima (6 ng cdk2/pozzetto, risultando in una concentrazione finale di 1,6 nM), che viene precedentemente diluito 1:50–1:200 nello stesso tampone, e lasciato procedere per 1 ora a temperatura ambiente. La reazione viene interrotta con l'aggiunta di 0,01 mL di acido fosforico al 10%, e 25 μL della miscela di reazione vengono trasferiti su carta da filtro in fosfocellulosa P30. Il tappetino filtrante viene lavato tre volte con acido fosforico all'1,0%, asciugato all'aria e quindi contato per la radioattività in un contatore a scintillazione liquida. Il saggio chinasico cdk4 per ciclina D1-cdk4 viene eseguito in un formato di micropiastra a 96 pozzetti di polipropilene misurando l'incorporazione di fosfato radioattivo in GST-Rb. La ciclina D1-cdk4 purificata viene incubata con 1 μg di GST-Rb in 20 mM HEPES (pH 7,5) in presenza di 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,01% Triton X-100 e 10% glicerolo. La concentrazione finale di cdk4 è di 10 ng/pozzetto, ovvero 1,6 nM. La reazione chinasica viene avviata con l'aggiunta di ATP a una concentrazione finale di 10 μM ATP (il doppio del Km determinato sperimentalmente) e [γ-³³P]ATP (1,0 μCi per pozzetto) in un volume di 60 μL e lasciata procedere a temperatura ambiente per 1 ora. La reazione viene interrotta con l'aggiunta di 0,01 ml di acido fosforico al 10%, e 25 μL della miscela di reazione vengono trasferiti su carta da filtro in fosfocellulosa P30. Il tappetino filtrante viene trattato come per i saggi Cdk1/Cdk2.