AT7519 HCl CDK inibitore

AT7519 è un inibitore di CDK competitivo con ATP con un valore K_i di 38 nM per CDK1. AT7519 è inattivo contro tutte le chinasi non-CDK ad eccezione di GSK3β (IC50 = 89 nM). AT7519 mostra una potente attività antiproliferativa in una varietà di linee cellulari tumorali umane con valori IC50 che vanno da 40 nM per MCF-7 a 940 nM per SW620, coerentemente con l'inibizione di CDK1 e CDK2. [1] AT7519 induce citotossicità dose-dipendente in linee cellulari di mieloma multiplo (MM) con valori IC50 che vanno da 0,5 a 2 μM a 48 ore, con le linee cellulari più sensibili MM.1S (0,5 μM) e U266 (0,5 μM) e la più resistente MM.1R (>2 μM). Non induce citotossicità nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMNC). AT7519 supera parzialmente il vantaggio proliferativo conferito da IL6 e IGF-1, nonché l'effetto protettivo delle cellule stromali del midollo osseo (BMSCs). AT7519 induce una rapida defosforilazione del CTD della RNA pol II nei siti serina 2 e serina 5 e porta all'inibizione della trascrizione, contribuendo parzialmente alla citotossicità delle cellule MM indotta da AT7519. AT7519 induce l'attivazione di GSK-3β mediante la regolazione negativa della fosforilazione di GSK-3β, che contribuisce anche all'apoptosi indotta da AT7519 indipendentemente dall'inibizione della trascrizione. [2]

Saggi chinasici in vitro

I saggi chinasici per CDK1, CDK2 e GSK3-β sono tutti eseguiti in un formato di legame su filtro radiometrico. I saggi per CDK5 sono in formato DELFIA e per CDK 4 e 6 in formato ELISA. Per CDK1 e 2, la CDK rilevante e 0,12 μg/mL di Istone H1 vengono incubate in 20 mM MOPS, pH 7,2, 25 mM β-glicerofosfato, 5 mM EDTA, 15 mM MgCl₂, 1 mM ortovanadato di sodio, 1 mM DTT, 0,1 mg/mL BSA, 45 μM ATP (0,78 Ci/mmol) e diverse concentrazioni di AT7519 rispettivamente per 2 o 4 ore. Per GSK3-β, l'enzima rilevante e 5 μM di peptide di glicogeno sintasi 2 insieme a 10 mM MOPS pH 7,0, 0,1 mg/mL BSA, 0,001% Brij-35, 0,5% glicerolo, 0,2 mM EDTA, 10 mM MgCl₂, 0,01% β-mercaptoetanolo, 15 μM ATP (2,31 Ci/mmol) e diverse concentrazioni di AT7519 vengono incubati per 3 ore. Le reazioni del saggio vengono interrotte aggiungendo un eccesso di acido ortofosforico e filtrate utilizzando piastre filtranti Millipore MAPH. Le piastre vengono quindi lavate, aggiunto uno scintillante e la radioattività misurata mediante conteggio a scintillazione su un Packard TopCount. Per CDK5, CDK5/p35 e 1 μM di un peptide Istone H1 biotinilato (Biotin-PKTPKKAKKL) vengono incubati in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM MgCl₂, 0,025% Brij-35, 0,1 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 15 μM ATP e diverse concentrazioni di AT7519 per 30 minuti. Le reazioni del saggio vengono interrotte usando EDTA, trasferite su piastre rivestite di Neutravidina e il peptide fosforilato quantificato per mezzo di un anticorpo policlonale di coniglio anti-substrato fosfo-cdk1 e un anticorpo secondario anti-coniglio IgG marcato con europio DELFIA utilizzando la fluorescenza risolta nel tempo a λ_ex=335nm, λ_em=620nm. Per i saggi CDK 4 e 6, le piastre vengono rivestite con GST-pRb769-921 e bloccate con Superblock. CDK4 o 6 viene incubato con 15 mM MgCl₂, 50 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,02% Triton X-100, 2,5% DMSO e diverse concentrazioni di AT7519; la reazione viene avviata con l'aggiunta di ATP. Dopo 30 minuti, le reazioni vengono interrotte con l'aggiunta di 0,5 M EDTA pH 8,0. Le piastre vengono quindi lavate e incubate per un'ora con l'anticorpo primario (anti-p-Rb Serina 780) diluito in Superblock, seguito dall'anticorpo secondario (anti-coniglio legato alla fosfatasi alcalina) per un'altra ora. Le piastre vengono sviluppate utilizzando il sistema Attophos e la fluorescenza letta su un lettore di piastre Spectramax Gemini a eccitazione 450 nm ed emissione 580 nm. In tutti i casi, i valori IC50 sono calcolati da curve replicate, utilizzando il software GraphPad Prism.

Una somministrazione di AT7519 (9,1 mg/kg) due volte al giorno causa la regressione tumorale di tumori s.c. sia in stadio precoce che avanzato nei modelli di xenotrapianto di cancro al colon HCT116 e HT29. [1] Il trattamento con AT7519 (15 mg/kg) inibisce la crescita tumorale e prolunga la sopravvivenza complessiva mediana dei topi nel modello murino di xenotrapianto di MM umano in associazione con un'aumentata attivazione della caspasi 3. [2]