LDN-57444 DUB inibitore

Il trattamento con 50 μM di LDN-57444 per 24 ore porta a un'inibizione del 70% dell'attività del proteasoma. Questo composto provoca una diminuzione significativa e concentrazione-dipendente della vitalità cellulare a concentrazioni superiori a 25 μM e la vitalità cellulare si riduce al 61,81% a 50 μM. È in grado di causare la morte cellulare attraverso il percorso dell'apoptosi diminuendo l'attività del sistema ubiquitina proteasoma e aumentando i livelli di proteine altamente ubiquitinate, entrambi i quali possono attivare la risposta proteica non ripiegata. L'apoptosi indotta da questa sostanza chimica può essere innescata dall'attivazione dello stress del reticolo endoplasmatico (ERS). [4]

Screening HTS

Per iniziare un saggio, 0,5 μL di composto di prova da 5 mg/mL (circa 50 μM di concentrazione di reazione finale) o controllo DMSO vengono aliquote in ciascun pozzetto. Sia l'enzima che il substrato sono preparati in tampone di reazione UCH (50 mM Tris-HCl [pH 7,6], 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT e 0,5 mg/mL di ovoalbumina). 25 μL di 0,6 nM UCH-L1 vengono quindi aggiunti a ciascun pozzetto eccetto i pozzetti di controllo del substrato, seguiti da agitazione della piastra per 45-60 s su uno shaker automatico. La miscela enzima/composto viene incubata a temperatura ambiente per 30 min prima di aggiungere 25 μL di 200 nM Ub-AMC per avviare la reazione enzimatica. La miscela di reazione (300 pM UCH-L1, 100 nM Ubiquitina-AMC con 2,5 μg di composto di prova) viene incubata a temperatura ambiente per altri 30 minuti prima di bloccare la reazione con l'aggiunta di 10 μL di acido acetico 500 mM per pozzetto. L'intensità di emissione della fluorescenza viene misurata su un LJL Analyst utilizzando un set di filtri alla cumarina (ex = 365 nm, em = 450 nm) e viene sottratta la fluorescenza intrinseca del composto per rivelare l'attività enzimatica. Un controllo DMSO (0,5 μL di DMSO, 25 μL di UCH-L1, 25 μL di ubiquitina-AMC, 10 μL di acido acetico), un controllo enzimatico (25 μL di UCH-L1, 25 μL di tampone, 10 μL di acido acetico), un controllo del substrato (25 μL di tampone, 25 μL di ubiquitina-AMC, 10 μL di acido acetico) e un controllo dell'inibitore (0,5 μL di aldeide di ubiquitina [stock 100 nM], 25 μL di UCH-L1, 25 μL di ubiquitina-AMC, 10 μL di acido acetico) vengono anche eseguiti in ciascuna piastra di saggio per garantire qualità e riproducibilità. I potenziali inibitori di UCH-L1 vengono selezionati se i composti hanno dimostrato un'inibizione superiore al 60% rispetto ai controlli. Le reazioni enzimatiche di UCH-L1 vengono ripetute manualmente due volte utilizzando lo stesso protocollo per confermare i risultati per i composti hit dallo screening primario assistito da robot.

LDN-57444 provoca drammatiche alterazioni nella distribuzione delle proteine sinaptiche e nella morfologia delle spine in vivo. Il trattamento con questo composto comporta anche una rapida caduta dell'attività di Uch-L1, ma l'inibizione del proteasoma non ha alcun effetto sui livelli di cAMP per un periodo di diverse ore. [3]