NVP-BSK805 2HCl JAK inibitore

NVP-BSK805 inibisce potentemente JAK2, mostrando una selettività di oltre 20 volte verso JAK1, JAK3 e TYK2. NVP-BSK805 provoca un'inibizione semimassimale degli enzimi JAK2^V617F a lunghezza intera e JAK2 wild-type a 0,5 nM. NVP-BSK805 blocca la crescita delle cellule JAK2^V617F (Ba/F3) e induce l'apoptosi con un GI50 a concentrazioni <100 nM. Poiché la fosforilazione costitutiva di STAT5 dipende da JAK2, NVP-BSK805 sopprime potentemente la fosforilazione di STAT5 a concentrazioni ">= 100 nM nelle linee cellulari mutanti JAK2^V617F, come MB-02. L'incubazione di cellule SET-2 con 150 nM e 1 µM di NVP-BSK805, che corrisponde a concentrazioni che producono rispettivamente il 75% e il 95% di inibizione della crescita, per 24, 48 e 72 ore, porta a un'induzione dell'apoptosi dipendente dalla concentrazione e dal tempo. Questi risultati sono evidenziati dalla rilevazione di PARP clivato, ridotta espressione di Bcl-xL e un forte aumento del numero di cellule con meno di 2N di contenuto di DNA. [1] La morte cellulare indotta da NVP-BSK805 richiede l'attivazione delle cascate di caspasi ed è superata dall'inibizione delle caspasi sia nelle cellule SET-2 che in quelle MB-02. NVP-BSK805 modula la modificazione post-traduzionale di Bim e i livelli di Mcl-1 nelle cellule JAK2^V617F, SET-2 e MB-02. [2]

Saggi enzimatici

Il dominio chinasico umano JAK2 (amminoacidi 840-1132) è contenuto nel costrutto plasmidico pAcG2TtevJAK2. I costrutti plasmidici per JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) e JAK1 (866-1154) sono progettati. La generazione dei baculovirus ricombinanti con DNA linearizzato BD BaculoGold^TM Bright, il saggio delle placche e l'amplificazione virale da placche singole sono eseguiti secondo il manuale (BD Biosciences Pharmingen). I domini chinasici Janus sono espressi in cellule Sf9 in flaconi da agitazione da 400 mL con 100 mL di terreno di coltura ExCell420 (JRH Biosciences Ltd) con soluzione di penicillina/streptomicina per 48 h a 27 °C. Le cellule in coltura in sospensione sono infettate a una densità di 1 × 10⁶ e la moltiplicità di infezione (MOI) per ciascun virus è ottimizzata per la resa di proteina solubile. Il dominio chinasico di JAK2 umano e di JAK1, JAK3 e TYK2 è espresso a un MOI di 1 e 0,5, rispettivamente. Il tempo di espressione a 27 °C è di 48 ore per JAK2 e di 48 ore o 72 ore per JAK1, JAK3 e TYK2. Quarantotto o settantadue ore dopo l'infezione, le cellule da una coltura di espressione di 100 mL vengono raccolte mediante centrifugazione a 3000 x g per 5 minuti e lisate con 12 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM ortovanadato di sodio, 1 % Triton X-100, 10 % glicerolo, 1 x cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA (Roche Diagnostics) e 12,5 U/mL Benzonase per 30 minuti a 4 °C, seguito da centrifugazione a 14.000 × g per 45 minuti per pelletare il materiale insolubile. Per la purificazione di affinità con tag GST delle proteine del dominio chinasico, tutti i passaggi sono eseguiti a 4 °C. I lisati chiarificati sono incubati con 0,2 mL di una sospensione al 50 % di Glutatione Sepharose 4B lavata per 2 ore a 4 °C, seguiti da 5 lavaggi con 1 mL di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT e 10 % glicerolo. La proteina legata viene eluita in 5 aliquote, ciascuna iniziando con un'incubazione di 10 minuti con 0,25 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glicerolo, 10 mM L-glutatione ridotto). Gli eluiti vengono concentrati circa 5 volte con colonne spin Amicon Ultra-4. Dopo l'aggiunta di Brij35 a una concentrazione finale dello 0,1 %, la proteina viene congelata rapidamente in piccole aliquote e conservata a -80 °C. In queste condizioni, le attività chinasiche sono stabili per almeno 6 mesi. Gli enzimi del dominio chinasico JAK sono incubati per 30 minuti a temperatura ambiente in un mezzo contenente 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM di substrato peptidico sintetico EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 e 50 mM Tris-HCl pH 7,5. La concentrazione di ATP è inferiore al Km per tutte le proteine. Le curve sono adattate mediante regressione non lineare utilizzando l'equazione logistica e la funzione di adattamento globale di XLfit® (modello 205). L'espressione e la caratterizzazione del JAK2 wild-type a lunghezza intera e mutante V617F, nonché le condizioni del saggio chinasico, sono state descritte altrove. La selettività chinasica di NVP-BSK805 è valutata in un pannello chinasico interno: nei saggi Caliper, le reazioni chinasiche sono eseguite con substrati peptidici che migrano con diverse velocità in un campo elettrico quando fosforilati. I peptidi portano un'etichetta fluorescente per consentire la rilevazione e la quantificazione dei peptidi in un sistema capillare. Le intensità di fluorescenza dei peptidi sono quantificate utilizzando lo strumento LC3000 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). L'attività chinasica è misurata quantificando la quantità di ATP residua in soluzione dopo una reazione chinasica. Nei saggi chinasici LanthaScreen™ TR-FRET, il terbio è usato come chelato di lantanide combinato con un anticorpo diretto contro il substrato fosforilato.

La biodisponibilità orale di NVP-BSK805 nei topi è stimata al 45%, mentre nei ratti è del 50%. La somministrazione orale di NVP-BSK805 a 150 mg/kg sopprime la fosforilazione di STAT5, la splenomegalia e la diffusione delle cellule leucemiche in un modello murino guidato da cellule Ba/F3 JAK2^V617F. NVP-BSK805 sopprime la fosforilazione di STAT5 indotta da rhEpo, così come la policitemia e la splenomegalia mediate da rhEpo nei topi BALB/c a dosi orali di 25, 50 e 100 mg/kg. [1]