NVP-BSK805 2HCl

Il dominio chinasico umano JAK2 (amminoacidi 840-1132) è contenuto nel costrutto plasmidico pAcG2TtevJAK2. I costrutti plasmidici per JAK3 (813-1124), TYK2 (888-1187) e JAK1 (866-1154) sono progettati. La generazione dei baculovirus ricombinanti con DNA linearizzato BD BaculoGold^TM Bright, il saggio delle placche e l'amplificazione virale da placche singole sono eseguiti secondo il manuale (BD Biosciences Pharmingen). I domini chinasici Janus sono espressi in cellule Sf9 in flaconi da agitazione da 400 mL con 100 mL di terreno di coltura ExCell420 (JRH Biosciences Ltd) con soluzione di penicillina/streptomicina per 48 h a 27 °C. Le cellule in coltura in sospensione sono infettate a una densità di 1 × 10⁶ e la moltiplicità di infezione (MOI) per ciascun virus è ottimizzata per la resa di proteina solubile. Il dominio chinasico di JAK2 umano e di JAK1, JAK3 e TYK2 è espresso a un MOI di 1 e 0,5, rispettivamente. Il tempo di espressione a 27 °C è di 48 ore per JAK2 e di 48 ore o 72 ore per JAK1, JAK3 e TYK2. Quarantotto o settantadue ore dopo l'infezione, le cellule da una coltura di espressione di 100 mL vengono raccolte mediante centrifugazione a 3000 x g per 5 minuti e lisate con 12 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM ortovanadato di sodio, 1 % Triton X-100, 10 % glicerolo, 1 x cocktail completo di inibitori della proteasi senza EDTA (Roche Diagnostics) e 12,5 U/mL Benzonase per 30 minuti a 4 °C, seguito da centrifugazione a 14.000 × g per 45 minuti per pelletare il materiale insolubile. Per la purificazione di affinità con tag GST delle proteine del dominio chinasico, tutti i passaggi sono eseguiti a 4 °C. I lisati chiarificati sono incubati con 0,2 mL di una sospensione al 50 % di Glutatione Sepharose 4B lavata per 2 ore a 4 °C, seguiti da 5 lavaggi con 1 mL di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT e 10 % glicerolo. La proteina legata viene eluita in 5 aliquote, ciascuna iniziando con un'incubazione di 10 minuti con 0,25 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 10 % glicerolo, 10 mM L-glutatione ridotto). Gli eluiti vengono concentrati circa 5 volte con colonne spin Amicon Ultra-4. Dopo l'aggiunta di Brij35 a una concentrazione finale dello 0,1 %, la proteina viene congelata rapidamente in piccole aliquote e conservata a -80 °C. In queste condizioni, le attività chinasiche sono stabili per almeno 6 mesi. Gli enzimi del dominio chinasico JAK sono incubati per 30 minuti a temperatura ambiente in un mezzo contenente 0,1 μM [γ³³P]-ATP, 1 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂, 30 μM di substrato peptidico sintetico EQEDEPEGDYFEWLE, 1 mM DTT, 1 % DMSO, 50 μg/mL BSA, 0,01 % Brij35 e 50 mM Tris-HCl pH 7,5. La concentrazione di ATP è inferiore al Km per tutte le proteine. Le curve sono adattate mediante regressione non lineare utilizzando l'equazione logistica e la funzione di adattamento globale di XLfit® (modello 205). L'espressione e la caratterizzazione del JAK2 wild-type a lunghezza intera e mutante V617F, nonché le condizioni del saggio chinasico, sono state descritte altrove. La selettività chinasica di NVP-BSK805 è valutata in un pannello chinasico interno: nei saggi Caliper, le reazioni chinasiche sono eseguite con substrati peptidici che migrano con diverse velocità in un campo elettrico quando fosforilati. I peptidi portano un'etichetta fluorescente per consentire la rilevazione e la quantificazione dei peptidi in un sistema capillare. Le intensità di fluorescenza dei peptidi sono quantificate utilizzando lo strumento LC3000 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA). L'attività chinasica è misurata quantificando la quantità di ATP residua in soluzione dopo una reazione chinasica. Nei saggi chinasici LanthaScreen™ TR-FRET, il terbio è usato come chelato di lantanide combinato con un anticorpo diretto contro il substrato fosforilato.

Ba/F3 cells

100 nM

72 hours

The anti-proliferative activity of JAK2 inhibitors is determined by incubating cells for 72 hours with an 8-point concentration range of compound and cell proliferation relative to DMSO-treated cells is measured using the colorimetric WST-1 (Roche Diagnostics GmbH) cell viability readout. Of each triplicate treatment, the mean is calculated and these data are plotted in XLfit 4 (ID Business Solutions, Ltd.) to determine the half-maximal growth inhibition (GI50) values.

RhEpo-induced polycythemia model in Female BALB/c mice

50, 75, and 100 mg/kg

Once daily oral administration