AMG319 PI3K inibitore

AMG319 inibisce la proliferazione delle cellule B indotta da anti-IgM/CD40L con una IC50 di 8,6 nM e riduce il livello di pAkt con una IC50 di 1,5 nM. Questo composto inibisce anche l'espressione di CD-69 indotta da anti-IgD in HWB. [1]

Saggi enzimatici PI3K

Un saggio Alphascreen PI3K viene utilizzato per misurare l'attività di un panel di quattro fosfoinositide 3-chinasi: PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ e PI3Kδ. Il tampone di reazione enzimatica viene preparato utilizzando acqua sterile e 50 mM Tris-HCl, pH 7, 14 mM MgCl₂, 2 mM colato di sodio e 100 mM NaCl. 2 mM DTT viene aggiunto fresco il giorno dell'esperimento. Il tampone Alphascreen viene preparato utilizzando acqua sterile e 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,10% Tween 20 e 30 mM EDTA. Quindi, 1 mM DTT viene aggiunto fresco il giorno dell'esperimento. Le piastre sorgente dei composti utilizzate per questo saggio sono piastre di polipropilene trasparente Greiner a 384 pozzetti contenenti composti di prova a 5 mM e diluiti 1:2 su 22 concentrazioni. Le colonne 23 e 24 contenevano solo DMSO, poiché questi pozzetti comprendevano rispettivamente i controlli positivo e negativo. Le piastre sorgente vengono replicate trasferendo 0,5 μL per pozzetto in Optiplate a 384 pozzetti. Ogni isoforma di PI3K viene diluita in tampone di reazione enzimatica a stock di lavoro 2×. PI3Kα viene diluita a 1,6 nM, PI3Kβ viene diluita a 0,8 nM, PI3Kγ viene diluita a 15 nM e PI3Kδ viene diluita a 1,6 nM. PI(4,5)P2 viene diluita a 10 μM e ATP è stato diluito a 20 μM. Questo stock 2× viene utilizzato nei saggi per PI3Kα e PI3Kβ. Per il saggio di PI3Kγ e PI3Kδ, PI(4,5)P2 viene diluita a 10 μM e ATP è stato diluito a 8 μM per preparare uno stock di lavoro 2× simile. Le soluzioni di reazione Alphascreen sono realizzate utilizzando perle dal kit Alphascreen anti-GST. Due stock di lavoro 4× dei reagenti Alphascreen vengono preparati in tampone di reazione Alphascreen. In uno stock, IP4 biotinilato viene diluito a 40 nM e le perle donatrici di streptavidina vengono diluite a 80 μg/mL. Nel secondo stock, la proteina legante PIP3 viene diluita a 40 nM e le perle accettrici anti-GST vengono diluite a 80 μg/mL. Come controllo negativo, un inibitore di riferimento a una concentrazione ≫Ki (40 μM) è incluso nella colonna 24 come controllo negativo (100% di inibizione). Utilizzando un Multidrop a 384 pozzetti, 10 μL/pozzetto di stock enzimatico 2× vengono aggiunti alle colonne 1–24 delle piastre del saggio per ogni isoforma. Una quantità di 10 μL/pozzetto dello stock 2× di substrato appropriato (contenente 20 μM ATP per i saggi PI3Kα e -β e contenente 8 μM ATP per i saggi PI3Kγ e -δ) viene quindi aggiunta alle colonne 1–24 di tutte le piastre. Le piastre vengono quindi incubate a temperatura ambiente per 20 min. Al buio, 10 μL/pozzetto della soluzione di perle donatrici vengono aggiunti alle colonne 1–24 delle piastre per estinguere la reazione enzimatica. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per 30 min. Ancora al buio, 10 μL/pozzetto della soluzione di perle accettrici vengono aggiunti alle colonne 1–24 delle piastre. Le piastre vengono quindi incubate al buio per 1,5 ore. Le piastre vengono lette su un lettore di piastre multimode Envision utilizzando un filtro di eccitazione di 680 nm e un filtro di emissione di 520–620 nm.

In ratti Lewis femmine, AMG319 (3 mg/kg, p.o.) inibisce la risposta infiammatoria indotta da KLH dell'88%. Nei topi transgenici (IgMm), questo composto (, p.o.) inibisce il pAKT in vivo con una IC50 di 1,9 nM. [1]