OSI-930 c-Kit inibitore

OSI-930 inibisce la proliferazione cellulare nella linea cellulare HMC-1 con IC50 di 14 nM senza effetti significativi sulla crescita della linea cellulare COLO-205 che non esprime un recettore tirosina chinasi mutante costitutivamente attivo. Inoltre, questo composto induce anche l'apoptosi nella linea cellulare HMC-1 con EC50 di 34 nM. [1] Uno studio recente mostra che questa sostanza chimica inattiva il citocromo P450 (P450) 3A4 purificato e ricombinante con un K_i di 24 μM in modalità tempo e concentrazione-dipendente. [2]

Saggi di protein chinasi

I saggi di protein chinasi vengono eseguiti internamente con metodi basati su ELISA (Kit, KDR, PDGFRα e PDGFRβ) o con un metodo radiometrico. I saggi ELISA interni utilizzavano poli(Glu:Tyr) come substrato legato alla superficie di piastre di saggio a 96 pozzetti; la fosforilazione viene quindi rilevata utilizzando un anticorpo antifosfotirosina coniugato con HRP. L'anticorpo legato viene quindi quantificato utilizzando ABTS come substrato perossidasi misurando l'assorbanza a 405/490 nm. Tutti i saggi utilizzano domini catalitici di chinasi ricombinanti purificati che sono espressi in cellule di insetto o in batteri. Le proteine Kit ed EGFR utilizzate per i saggi interni sono preparate internamente; altri enzimi sono ottenuti. La proteina ricombinante Kit viene espressa come proteina di fusione glutatione S-transferasi NH₂-terminale in cellule di insetto e viene inizialmente purificata come un enzima non fosforilato (non attivato) con un K_m relativamente alto per l'ATP (400 μM). In alcuni saggi, una forma attivata (tirosina fosforilata) dell'enzima viene preparata mediante incubazione con 1 mM di ATP per 1 ora a 30 °C. La proteina fosforilata viene quindi fatta passare attraverso una colonna di desalinizzazione per rimuovere la maggior parte dell'ATP e conservata a -80 °C in tampone contenente 50% di glicerolo. La preparazione risultante ha un'attività specifica considerevolmente più alta e un Km per l'ATP (25 μM) inferiore rispetto alla preparazione iniziale non fosforilata. L'inibizione dell'autofosforilazione di Kit da parte di questo composto viene saggiata mediante incubazione dell'enzima non fosforilato a 30 °C in presenza di 200 μM di ATP e varie concentrazioni di questa sostanza chimica. La reazione viene arrestata rimuovendo aliquote in tampone campione SDS-PAGE seguite da riscaldamento a 100 °C per 5 minuti. Il grado di fosforilazione di Kit viene quindi determinato mediante immunoblotting per Kit totale e Kit fosforilato.

OSI-930, somministrato alla dose massimamente efficace di 200 mg/kg mediante gavage orale, mostra una potente attività antitumorale in un'ampia gamma di modelli di xenotrapianto preclinici, inclusi i modelli di xenotrapianto HMC-1, NCI-SNU-5, COLO-205 e U251. [1]