WYE-125132 (WYE-132) mTOR inibitore

A highly potent, ATP-competitive, and specific mTOR kinase inhibitor.

WYE-125132 (WYE-132) inibisce potentemente e in modo ATP-competitivo la chinasi mTOR ricombinante con un'IC50 di 0,19 nM e mostra anche un'elevata selettività rispetto a varie PI3K e un pannello di 230 chinasi proteiche. [1] In vitro, mostra una significativa attività antiproliferativa contro un pannello di linee cellulari tumorali con IC50 che vanno da 2 nM (LNCap) a 380 nM (HTC116). Inoltre, questo composto causa anche la progressione del ciclo cellulare, l'induzione dell'apoptosi e l'inibizione della sintesi proteica e delle dimensioni cellulari. [1] Comporta una significativa riduzione della sintesi di pre-tRNA^Leu del 72%, 80% e 53% in cellule di MG63, MDA361 e HEK293 attivamente proliferanti, rispettivamente, inibendo mTORC1. Inoltre, si è scoperto che WYE-125132 induce anche la defosforilazione di Maf1 (regolatore negativo della trascrizione di Pol III) e il suo accumulo nel nucleo. [2]

Saggi di chinasi

I saggi enzimatici di mTOR tramite immunoassaggio a fluorescenza di lantanidi potenziato dalla dissociazione (DELFIA), saggi su matrice di ATP e saggi di chinasi del complesso immunitario di mTOR sono eseguiti come segue per WYE-125132 (WYE-132). Il TOR endogeno del lisato cellulare LNCap viene immunoprecipitato da anti-FRAP/TOR (N-19). Il lisato cellulare (1,0 mg) viene miscelato con 4 μg di anticorpo accoppiato ad agarosio proteina-G/A in 1 mL di tampone di lisi. I complessi immunitari vengono lavati sequenzialmente con tampone di lisi, tampone di lisi più 500 mM KCl e tampone di lavaggio per chinasi. I complessi immunitari vengono sottoposti a reazione chinasica per 30 minuti a 30 °C in un volume finale di 50 μL contenente 10 mM Hepes (pH 7,4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato e 0,5 μM microcistina LR, 1 mM DTT, 10 mM MnCl₂, 100 μM ATP, 1 μg His6-S6K o 1 μg His6-4EBP1. Le reazioni chinasiche (enzimi in complesso immunitario ed enzimi purificati) vengono terminate con tampone campione NuPAGE LDS e risolte in un gel NuPAGE Bis-Tris 4-12% per Western blotting con anti-P(T389)-p70S6K e anti-P(T46)-4EBP1, anti-FRAP/TOR (N-19), anti-FLAG M2 e anti-His6 (Clone His-1). Nel saggio radioattivo, vengono utilizzati 10 μCi [γ-³²P]ATP (3000 Ci/mmol) e 100 μM di ATP freddo. I prodotti marcati con ³²P vengono risolti mediante SDS-PAGE e sottoposti ad autoradiogramma su pellicole radiografiche Kodak.

WYE-125132 (WYE-132) (5 mg/kg p.o.) produce una significativa attività antitumorale e provoca un ritardo della crescita tumorale dose-dipendente nel modello tumorale MDA361 iperattivo per PI3K/mTOR e HER2. Inoltre, mostra anche una potente efficacia antitumorale nei modelli di glioma U87MG PTEN-nullo, e di carcinoma polmonare non a piccole cellule H1975 e A549. [1]