WAY-600 mTOR inhibitor

Immune-complex kinase assay shows mTORC2-specific substrate His6-AKT or the mTORC1 substrate His6-S6K is dose dependently inhibited by WAY-600. This compound globally inhibits mTOR signaling and AKT function in cellular models dose dependently. It profoundly inhibits cap-dependent and global protein synthesis in MDA361, human breast cancer cells. This chemical shows antiproliferative effects in various cancer cell lines involving G1 cell cycle arrest and selective apoptosis. It down-regulate angiogenic factors, VEGF and HIF-1α, in U87MG, MDA361 and LNCap cells. [1]

Formato DELFIA di FLAG-TOR purificato

I saggi di routine con FLAG-TOR purificato (FL e 3.5) vengono eseguiti in piastre a 96 pozzetti come segue. Gli enzimi vengono prima diluiti nel tampone di saggio della chinasi (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 lM microcistina LR e 100 lg/mL BSA). Ad ogni pozzetto, 12 μL dell'enzima diluito vengono miscelati brevemente con 0.5 μL di inibitore di prova o veicolo di controllo dimetilsolfossido (DMSO). La reazione della chinasi viene avviata aggiungendo 12.5 μL di tampone di saggio della chinasi contenente ATP e His6-S6K per ottenere un volume di reazione finale di 25 μL contenente 800 ng/mL di FLAG-TOR, 100 μM di ATP e 1.25 μM di His6-S6K. La piastra di reazione viene incubata per 2 ore (lineare da 1 a 6 ore) a temperatura ambiente con agitazione delicata e quindi terminata aggiungendo 25 μL di tampone di arresto (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA e 20 mM EGTA). La rilevazione DELFIA dell'His6-S6K fosforilato (Thr-389) viene eseguita a temperatura ambiente utilizzando un anticorpo monoclonale anti-P(T389)-p70S6K (1A5) marcato con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu per anticorpo). Quarantacinque microlitri della miscela di reazione della chinasi terminata vengono trasferiti in una piastra MaxiSorp contenente 55 μL di PBS. L'His6-S6K viene lasciato aderire per 2 ore, dopodiché i pozzetti vengono aspirati e lavati una volta con PBS. Vengono aggiunti cento microlitri di tampone DELFIA con 40 ng/mL di anticorpo Eu-P(T389)-S6K. Il legame dell'anticorpo viene continuato per 1 ora con agitazione delicata. I pozzetti vengono quindi aspirati e lavati quattro volte con PBS contenente 0.05% di Tween 20 (PBST). Vengono aggiunti cento microlitri di soluzione di potenziamento DELFIA a ciascun pozzetto e le piastre vengono lette in un lettore di piastre PerkinElmer modello Victor. I dati ottenuti vengono utilizzati per calcolare l'attività enzimatica e l'inibizione enzimatica da parte di potenziali inibitori.