WAY-600 mTOR inibitore

Il saggio della chinasi in immunocomplessi mostra che il substrato specifico di mTORC2 His6-AKT o il substrato di mTORC1 His6-S6K sono inibiti in modo dose-dipendente da WAY-600. Questo composto inibisce globalmente la segnalazione di mTOR e la funzione di AKT in modelli cellulari in modo dose-dipendente. Inibisce profondamente la sintesi proteica cap-dipendente e globale nelle cellule di cancro al seno umano MDA361. Questa sostanza chimica mostra effetti antiproliferativi in varie linee cellulari tumorali che coinvolgono l'arresto del ciclo cellulare in fase G1 e l'apoptosi selettiva. Down-regola i fattori angiogenici, VEGF e HIF-1α, nelle cellule U87MG, MDA361 e LNCap. [1]

Formato DELFIA di FLAG-TOR purificato

I saggi di routine con FLAG-TOR purificato (FL e 3.5) vengono eseguiti in piastre a 96 pozzetti come segue. Gli enzimi vengono prima diluiti nel tampone di saggio della chinasi (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 lM microcistina LR e 100 lg/mL BSA). Ad ogni pozzetto, 12 μL dell'enzima diluito vengono miscelati brevemente con 0.5 μL di inibitore di prova o veicolo di controllo dimetilsolfossido (DMSO). La reazione della chinasi viene avviata aggiungendo 12.5 μL di tampone di saggio della chinasi contenente ATP e His6-S6K per ottenere un volume di reazione finale di 25 μL contenente 800 ng/mL di FLAG-TOR, 100 μM di ATP e 1.25 μM di His6-S6K. La piastra di reazione viene incubata per 2 ore (lineare da 1 a 6 ore) a temperatura ambiente con agitazione delicata e quindi terminata aggiungendo 25 μL di tampone di arresto (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA e 20 mM EGTA). La rilevazione DELFIA dell'His6-S6K fosforilato (Thr-389) viene eseguita a temperatura ambiente utilizzando un anticorpo monoclonale anti-P(T389)-p70S6K (1A5) marcato con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu per anticorpo). Quarantacinque microlitri della miscela di reazione della chinasi terminata vengono trasferiti in una piastra MaxiSorp contenente 55 μL di PBS. L'His6-S6K viene lasciato aderire per 2 ore, dopodiché i pozzetti vengono aspirati e lavati una volta con PBS. Vengono aggiunti cento microlitri di tampone DELFIA con 40 ng/mL di anticorpo Eu-P(T389)-S6K. Il legame dell'anticorpo viene continuato per 1 ora con agitazione delicata. I pozzetti vengono quindi aspirati e lavati quattro volte con PBS contenente 0.05% di Tween 20 (PBST). Vengono aggiunti cento microlitri di soluzione di potenziamento DELFIA a ciascun pozzetto e le piastre vengono lette in un lettore di piastre PerkinElmer modello Victor. I dati ottenuti vengono utilizzati per calcolare l'attività enzimatica e l'inibizione enzimatica da parte di potenziali inibitori.