BX-912 PDK inhibitor

BX912 previene ChcK1, PKA, c-kit e KDR con IC50 di 0,83, 0,11, 0,85 e 0,41 μM, rispettivamente. BX912 blocca la segnalazione PDK1/Akt nelle cellule tumorali e sopprime la crescita dipendente dall'ancoraggio di una varietà di linee cellulari tumorali (come le cellule PC-3) in coltura o induce l'apoptosi. Un certo numero di linee cellulari cancerose (come il cancro al seno MDA-468) con attività Akt elevata sono >30 volte più sensibili all'inibizione della crescita da parte dell'inibitore di PDK1 BX912 in agar molle rispetto alla plastica per colture tissutali, coerentemente con la funzione di sopravvivenza cellulare della via di segnalazione PDK1/Akt, che è particolarmente importante per le cellule non adese. BX912 blocca potentemente l'attività enzimatica di PDK1 in un formato di dosaggio chinasico diretto, sebbene BX912 non riesca a bloccare l'attività di AKT2 preattivata (IC50 > 10 μM). Pertanto, BX-912 è un inibitore diretto di PDK1. BX912 è un inibitore competitivo dell'attività di PDK1 rispetto al suo substrato, l'ATP, il che suggerisce che BX912 si leghi alla tasca di legame dell'ATP di PDK1. Lo scheletro aminopirimidinico di BX912 adotta un orientamento simile nel sito attivo di PDK1. BX912 promuove un aumento pronunciato nella popolazione di cellule MDA-468 con contenuto di DNA 4 N, indicativo di un blocco nella fase G2/M del ciclo cellulare. BX912 inibisce anche potentemente la crescita delle cellule HCT-116 in agar molle, mostrando un effetto inibitorio del 96% a una dose di 1 μM. BX912 inibisce potentemente la crescita delle cellule PC-3 in agar molle, mostrando una IC50 di 0,32 μM. [1]

Saggi chinasici

PDK1 viene saggiata in un saggio chinasico diretto e in un formato di saggio accoppiato che misura l'attivazione di AKT2 mediata da PDK1 e PtdIns-3,4-P2. Per il saggio accoppiato, la miscela di saggio finale (60 μL) conteneva: 15 mM MOPS, pH 7,2, 1 mg/mL di sieroalbumina bovina, 18 mM β-glicerolo fosfato, 0,7 mM ditiotreitolo, 3 mM EGTA, 10 mM MgOAc, 7,5 μM ATP, 0,2 μCi di [γ- ³³P]ATP, 7,5 μM di substrato peptidico biotinilato (biotin-ARRRDGGGAQPFRPRAATF), 0,5 μL di vescicole fosfolipidiche contenenti PtdIns-3,4-P2, 60 pg di PDK1 umana ricombinante purificata e 172 ng di AKT2 umana ricombinante purificata. Dopo incubazione per 2 ore a temperatura ambiente, il peptide marcato con biotina viene catturato da 10 μL della miscela di saggio su sfere SPA rivestite di streptavidina e la formazione del prodotto viene misurata mediante scintillazione di prossimità in un contatore Wallac MicroBeta. Il prodotto formato è proporzionale al tempo di incubazione e alla quantità di PDK1 e AKT2 inattiva aggiunta. La PDK1 viene aggiunta a livelli subottimali in modo che il saggio possa rilevare in modo sensibile gli inibitori dell'attivazione di AKT2 così come l'inibitore diretto BX-912 di PDK1 o AKT2. Per misurare direttamente l'attività di PDK1, la miscela di saggio finale (60 μL) conteneva 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1 mM EDTA, 0,1% β-mercaptoetanolo, 1 mg/mL di sieroalbumina bovina, 10 mM MgOAc, 10 μM ATP, 0,2 μCi di [γ-³³P]ATP, 7,5 μM di peptide substrato (H2N-ARRRGVTTKTFCGT) e 60 ng di PDK1 umana ricombinante purificata. Dopo 4 ore a temperatura ambiente, vengono aggiunti 25 mM di EDTA e una porzione della miscela di reazione viene depositata su carta fosfocellulosica P81. La carta da filtro viene lavata tre volte con acido fosforico allo 0,75% e una volta con acetone. Dopo l'asciugatura, il peptide marcato legato al filtro viene quantificato utilizzando un phosphorimager.