NMS-873 p97 inibitore

The most potent and specific p97 inhibitor described to date.

NMS-873 riduce la sensibilità di p97 alla digestione con tripsina, prevenendo la degradazione del dominio linker-D2. Questo composto, come inibitore di p97, produce attività antiproliferativa in una varietà di linee tumorali ematologiche e solide. Lo studio del meccanismo indica che questa sostanza chimica attiva la risposta delle proteine non ripiegate, interferisce con l'autofagia e induce così la morte delle cellule tumorali. [1]

Sviluppo di saggi biochimici e HTS

L'attività ATPasica e i parametri cinetici di VCP ricombinante di tipo selvaggio e dei suoi mutanti vengono valutati monitorando la formazione di ADP nella reazione, utilizzando un saggio accoppiato al NADH modificato. Poiché ADP e NADH sono inibitori competitivi dell'ATP dell'attività ATPasica di VCP, il protocollo standard per il saggio accoppiato al NADH viene modificato in una procedura a due fasi. Nella prima parte, un sistema di rigenerazione dell'ATP (40 U/ml di piruvato chinasi e 3 mM di fosfoenolpiruvato) ricicla l'ADP prodotto dall'attività di VCP, mantiene costante la concentrazione del substrato (prevenendo così l'inibizione del prodotto) e accumula una quantità stechiometrica di piruvato. Nella seconda parte, la reazione enzimatica di VCP viene spenta con 30 mM di EDTA e 250 μM di NADH e ossidata stechiometricamente da 40 U/ml di lattato deidrogenasi per ridurre il piruvato accumulato. La diminuzione della concentrazione di NADH viene misurata a 340 nm utilizzando una piastra lettore Tecan Safire 2. Il saggio viene eseguito in piastre UV a 96 o 384 pozzetti in un tampone di reazione con 50 mM Hepes, pH 7,5, 0,2 mg/mL BSA, 10 mM MgCl₂ e 2 mM DTT. I dati sperimentali vengono interpolati con un'equazione cooperativa ottenendo un Ks* di circa 60 μM e un coefficiente di Hill (n) di 2,0 ± 0,1. La campagna HTS viene eseguita contro una libreria di 1 milione di composti utilizzando un saggio miniaturizzato in formato a 1.536 pozzetti e un sistema di rilevamento dell'ADP più sensibile, Transcreener ADP FP. Viene eseguita una preincubazione di 20 minuti di 10 nM VCP e 10 μM di inibitore, dopodiché vengono aggiunti 10 μM di ATP alla reazione, che viene lasciata procedere per 90 minuti prima dello spegnimento. Lo Z' medio dello screening è 0,58 e il tasso di successo utilizzando 3× d.s. (38% di inibizione) come cutoff è 1,7%. I hit primari con >60% di inibizione a una concentrazione di 10 μM vengono selezionati utilizzando filtri fisico-chimici e strutturali per lasciare 7.516 composti. Alla fine, la riconferma viene eseguita in duplicato su 3.988 hit primari e 500 composti vengono selezionati per una valutazione dose-risposta utilizzando il saggio accoppiato modificato con NADH descritto in precedenza. La potenza dei hit HTS più interessanti viene misurata sia contro la VCP di tipo selvaggio che contro il mutante C522T. Le concentrazioni di ATP che hanno prodotto la velocità semimassima (Ks*) per ciascun enzima, corrispondenti a 60 μM e 130 μM per il tipo selvaggio e il mutante C522T, rispettivamente, vengono utilizzate nel saggio. Per esplorare la dipendenza degli inibitori reversibili dalla concentrazione del substrato, la loro potenza viene valutata anche a concentrazione di ATP saturante (1 mM) e confrontata con la potenza di un inibitore competitivo standard dell'ATP (AMP-PNP).