NMS-873

L'attività ATPasica e i parametri cinetici di VCP ricombinante di tipo selvaggio e dei suoi mutanti vengono valutati monitorando la formazione di ADP nella reazione, utilizzando un saggio accoppiato al NADH modificato. Poiché ADP e NADH sono inibitori competitivi dell'ATP dell'attività ATPasica di VCP, il protocollo standard per il saggio accoppiato al NADH viene modificato in una procedura a due fasi. Nella prima parte, un sistema di rigenerazione dell'ATP (40 U/ml di piruvato chinasi e 3 mM di fosfoenolpiruvato) ricicla l'ADP prodotto dall'attività di VCP, mantiene costante la concentrazione del substrato (prevenendo così l'inibizione del prodotto) e accumula una quantità stechiometrica di piruvato. Nella seconda parte, la reazione enzimatica di VCP viene spenta con 30 mM di EDTA e 250 μM di NADH e ossidata stechiometricamente da 40 U/ml di lattato deidrogenasi per ridurre il piruvato accumulato. La diminuzione della concentrazione di NADH viene misurata a 340 nm utilizzando una piastra lettore Tecan Safire 2. Il saggio viene eseguito in piastre UV a 96 o 384 pozzetti in un tampone di reazione con 50 mM Hepes, pH 7,5, 0,2 mg/mL BSA, 10 mM MgCl₂ e 2 mM DTT. I dati sperimentali vengono interpolati con un'equazione cooperativa ottenendo un Ks* di circa 60 μM e un coefficiente di Hill (n) di 2,0 ± 0,1. La campagna HTS viene eseguita contro una libreria di 1 milione di composti utilizzando un saggio miniaturizzato in formato a 1.536 pozzetti e un sistema di rilevamento dell'ADP più sensibile, Transcreener ADP FP. Viene eseguita una preincubazione di 20 minuti di 10 nM VCP e 10 μM di inibitore, dopodiché vengono aggiunti 10 μM di ATP alla reazione, che viene lasciata procedere per 90 minuti prima dello spegnimento. Lo Z' medio dello screening è 0,58 e il tasso di successo utilizzando 3× d.s. (38% di inibizione) come cutoff è 1,7%. I hit primari con >60% di inibizione a una concentrazione di 10 μM vengono selezionati utilizzando filtri fisico-chimici e strutturali per lasciare 7.516 composti. Alla fine, la riconferma viene eseguita in duplicato su 3.988 hit primari e 500 composti vengono selezionati per una valutazione dose-risposta utilizzando il saggio accoppiato modificato con NADH descritto in precedenza. La potenza dei hit HTS più interessanti viene misurata sia contro la VCP di tipo selvaggio che contro il mutante C522T. Le concentrazioni di ATP che hanno prodotto la velocità semimassima (Ks*) per ciascun enzima, corrispondenti a 60 μM e 130 μM per il tipo selvaggio e il mutante C522T, rispettivamente, vengono utilizzate nel saggio. Per esplorare la dipendenza degli inibitori reversibili dalla concentrazione del substrato, la loro potenza viene valutata anche a concentrazione di ATP saturante (1 mM) e confrontata con la potenza di un inibitore competitivo standard dell'ATP (AMP-PNP).

A variety of hematological and solid tumor lines

~10 μM

72 hours

Cells are seeded at 1,600 cells per well in 384-well white clear-bottom plates. Twenty-four hours after seeding, cells are treated with the compounds (eight dilution points, in duplicate, for each compound) and incubated for an additional 72 h at 37 °C under a 5% CO₂ atmosphere. Cells are then lysed, and the ATP content in each well is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay as a measure of cell viability. IC50 values are calculated using the percentage of growth of treated cells versus the untreated control.