NH125 CaMK inibitore

Nelle cellule di glioma C6, NH125 diminuisce il contenuto cellulare di fosfo-eEF-2 senza influenzare il contenuto totale di eEF-2 e blocca il transito del ciclo cellulare al confine G1-S. Questo composto inibisce potentemente la vitalità cellulare di 10 cellule tumorali con IC50 che vanno da 0,7 a 4,8 μM. [1] Inibisce efficacemente le istidina protein chinasi, inclusi Envz, PhoQ, BvgS, EvgS, e produce quindi potenti attività antibatteriche su Staphylococcus aureus resistente all'oxacillina (ORSA), Enterococcus faecalis resistente alla vancomicina (VRE), Streptococcus pneumoniae resistente alla penicillina (PRS) e altri batteri Gram-positivi e Gram-negativi. [2] L'inibizione di EEF2K da parte di questa sostanza chimica rende le cellule tumorali più sensibili alla curcumina e al velcade, che possiedono un'azione inducente lo stress del RE. [3]

Saggio della eEF-2 Chinasi

L'attività della eEF-2 chinasi è misurata con due metodi: (a) un saggio basato su filtro; e (b) mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti-fosfo-eEF2. Per entrambi, le reazioni sono condotte in un volume totale di 20 μl contenente 50 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 1.5 mM CaCl₂, 100 μg/ml di calmodulina, 2 μM di eEF-2 marcato con His e 400 nM di GST-eEF-2 chinasi, e miscela di ATP [50 μM ATP con 1 μCi (γ-³³P)ATP]. La miscela di chinasi senza ATP viene preparata su ghiaccio e poi preincubata per 15 minuti a temperatura ambiente. Le reazioni di chinasi vengono avviate aggiungendo ATP e lasciate progredire a 30°C per 30 minuti. Per il saggio basato su filtro, la reazione viene terminata aggiungendo 20 μl di acido fosforico freddo all'1,5%, e 5 μl della reazione vengono applicati su carta fosfocellulosa P81 Whatman. La carta viene lavata tre volte in 500 ml di acido fosforico allo 0,5% e una volta con 200 ml di acetone. La carta viene quindi asciugata all'aria e immersa in 10 ml di miscela di scintillazione. La radioattività viene contata utilizzando un contatore a scintillazione liquida Beckton-Dickinson. Per l'immunoblotting, le reazioni vengono interrotte aggiungendo 20 μl di tampone Lamelli 3× [190 mM Tris (pH 6.8), 6% SDS, 30% glicerolo, 15% 2-mercaptoetanolo e 0,003% di colorante blu di bromofenolo]. I campioni vengono bolliti per 5 minuti e risolti mediante SDS-PAGE al 7% e processati per Western blotting come descritto di seguito. Le condizioni per entrambi i saggi sono scelte per garantire la linearità della reazione rispetto al tempo di incubazione e alla concentrazione dell'enzima.

NH125 riduce la pressione sanguigna nei ratti SHR e la produzione di ROS, l'induzione di molecole infiammatorie e l'ipertrofia nell'arteria mesenterica superiore dei ratti SHR. [4]