PNU-120596 AChR Modulatore

PNU-120596 increases agonist (Ach)-evoked calcium flux mediated by an engineered variant of the human α7 nAChR. This compound increases agonists (choline and ACh)-evoked currents mediated by wild-type receptors and also demonstrates a pronounced prolongation of the evoked response in the continued presence of agonist in Xenopus oocytes. It increases the channel mean open time ofα7 nAChRs but has no effect on ion selectivity and relatively little, if any, effect on unitary conductance. When applied to acute hippocampal slices, this chemical increases the frequency of ACh-evoked GABAergic postsynaptic currents measured in pyramidal neurons; this effect is suppressed by TTX, suggesting that it modulates the function of α7 nAChRs located on the somatodendritic membrane of hippocampal interneurons. [1] Besides the positive modulation to α7 nAChR, this compound induces a profound retardation of the kinetics of desensitization, raising the potential of Ca²⁺-induced toxicity through excessive stimulation of α7 nAChR. [2] It causes changes in cysteine accessibility at the inner beta sheet, transition zone and agonist binding site while binding to α7 nAChR. Binding sites for this chemical are not in the agonist-binding sites and it enhances agonist-evoked gating of nicotinic receptors by eliciting conformational effects that are similar but nonidentical to the gating conformations promoted by Ach. [3]

Saggio di fluorescenza Ca²⁺

Le cellule epiteliali umane SH-EP1 che esprimono una variante del α7 nAChR (α7^*) vengono coltivate in un terreno essenziale minimo (MEM) contenente amminoacidi non essenziali supplementato con il 10% di siero bovino fetale, L-glutammina, 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 250 ng/mL di fungizone, 400 μg/mL di igromicina B e 800 μg/mL di geneticina. α7^* è una variante del α7 nAChR umano, con due mutazioni puntiformi nel primo dominio transmembrana (T230P e C241S) che consentono un'elevata espressione funzionale nelle cellule SH-EP1 [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Le cellule vengono coltivate in un incubatore a 37 °C con 6% di CO₂. Le cellule vengono tripsinizzate e piastrate in piastre a 96 pozzetti con pareti laterali scure e fondi trasparenti a una densità di 2 × 10⁴ cellule/pozzetto 2 giorni prima dell'analisi. Le cellule vengono caricate con una miscela di Calcium Green-1 AM in dimetilsolfossido anidro e 20% di pluronic F-127. Questo reagente viene aggiunto direttamente al terreno di crescita di ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 2 μM di Calcium Green-1 AM. Le cellule vengono quindi incubate nel colorante per 1 ora a 37 °C e quindi lavate quattro volte con la soluzione salina bilanciata di Earle modificata da Mark (MMEBSS) composta come segue (in mM): 4 CaCl₂, 0,8 MgSO₄, 20 NaCl, 5,3 KCl, 5,6 D-glucosio, 20 Tris-HEPES e 120 N-metil-D-glucamina, pH 7,4. Dopo il quarto ciclo, le cellule vengono lasciate incubare a 37 °C per almeno 10 minuti. Il volume finale di MMEBSS in ciascun pozzetto è di 100 μL e l'atropina viene aggiunta a tutti i pozzetti per una concentrazione finale di 1 μM. Un lettore di piastre per imaging fluorimetrico (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) è impostato per eccitare il Calcium Green a 488 nm utilizzando 500 mW di potenza e leggendo l'emissione di fluorescenza >525 nm. Viene utilizzata un'esposizione di 0,5 secondi per illuminare ciascun pozzetto. La fluorescenza viene rilevata utilizzando un set F-stop di 2,0 o 1,2. Dopo 30 secondi di registrazione di base, i composti di prova vengono aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 50 μL di uno stock 3 ×. In ogni esperimento, quattro pozzetti vengono utilizzati come controlli del veicolo (0,2% DMSO).

Systemic administration of PNU-120596 (1 mg/kg) to rats improves the auditory gating deficit caused by amphetamine, a model proposed to reflect a circuit level disturbance associated with schizophrenia. [1] When administered prior to Carrageenan, 30 mg/kg of this compound significantly blunts mechanical hyperalgesia and weight bearing deficits for up to 4 hours. This chemical attenuates the carrageenan-induced increase in levels of TNF-α and IL-6 within the hindpaw oedema, diclofenac only attenuated IL-6 levels. Established mechanical hyperalgesia induced by Carrageenan or CFA is also partially reversed by this agent. [4]