PNU-120596

Le cellule epiteliali umane SH-EP1 che esprimono una variante del α7 nAChR (α7^*) vengono coltivate in un terreno essenziale minimo (MEM) contenente amminoacidi non essenziali supplementato con il 10% di siero bovino fetale, L-glutammina, 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 250 ng/mL di fungizone, 400 μg/mL di igromicina B e 800 μg/mL di geneticina. α7^* è una variante del α7 nAChR umano, con due mutazioni puntiformi nel primo dominio transmembrana (T230P e C241S) che consentono un'elevata espressione funzionale nelle cellule SH-EP1 [Groppi VE, Wolfe ML, Berkenpas MB (2003) U.S. Patent 6,693,172 B1]. Le cellule vengono coltivate in un incubatore a 37 °C con 6% di CO₂. Le cellule vengono tripsinizzate e piastrate in piastre a 96 pozzetti con pareti laterali scure e fondi trasparenti a una densità di 2 × 10⁴ cellule/pozzetto 2 giorni prima dell'analisi. Le cellule vengono caricate con una miscela di Calcium Green-1 AM in dimetilsolfossido anidro e 20% di pluronic F-127. Questo reagente viene aggiunto direttamente al terreno di crescita di ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 2 μM di Calcium Green-1 AM. Le cellule vengono quindi incubate nel colorante per 1 ora a 37 °C e quindi lavate quattro volte con la soluzione salina bilanciata di Earle modificata da Mark (MMEBSS) composta come segue (in mM): 4 CaCl₂, 0,8 MgSO₄, 20 NaCl, 5,3 KCl, 5,6 D-glucosio, 20 Tris-HEPES e 120 N-metil-D-glucamina, pH 7,4. Dopo il quarto ciclo, le cellule vengono lasciate incubare a 37 °C per almeno 10 minuti. Il volume finale di MMEBSS in ciascun pozzetto è di 100 μL e l'atropina viene aggiunta a tutti i pozzetti per una concentrazione finale di 1 μM. Un lettore di piastre per imaging fluorimetrico (FLIPR; Molecular Devices, Union City, CA) è impostato per eccitare il Calcium Green a 488 nm utilizzando 500 mW di potenza e leggendo l'emissione di fluorescenza >525 nm. Viene utilizzata un'esposizione di 0,5 secondi per illuminare ciascun pozzetto. La fluorescenza viene rilevata utilizzando un set F-stop di 2,0 o 1,2. Dopo 30 secondi di registrazione di base, i composti di prova vengono aggiunti a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 50 μL di uno stock 3 ×. In ogni esperimento, quattro pozzetti vengono utilizzati come controlli del veicolo (0,2% DMSO).

SH-SY5Y-α7 cells

3-10 μM

24 hours

SH-SY5Y-α7 cells are plated on 96-well plates at a density of 15,000 cells per well (100 μL of 1.5 × 10⁵ cells per mL) in complete growth medium and placed into a 37 °C incubator for 20 to 24 hours. Complete growth medium then is replaced with experimental medium alone ("PNU-120596 free") or containing appropriate concentrations of this compound and returns to the 37 °C ncubator for 20 to 24 hours. The medium is then replaced with fresh experimental medium and 20 μL per well MTS solution and returned to the 37 °C incubator for 3 hours, after which the plate is read on a microplate spectrophotometer at an absorbance of 490 nm. For all data analysis, data are normalized to untreated compound-free wells (100% cell viability) and a background absorbance taken from wells containing experimental medium and MTS solution.

male Sprague Dawley rats (weighing 250–300 g)

1 mg/kg

PNU-120596 is intravenously administrated 5 minutes before auditory gating measurements.