Anti-DYKDDDDK Tag magnetic beads

Vantaggi

Confronto Prodotto

Descrizione

Le microsfere magnetiche Anti-DYKDDDDK Tag sono basate su microsfere magnetiche idrossilate accoppiate covalentemente con anticorpi monoclonali di topo ricombinanti di alta qualità. Con un alto carico di proteina DYKDDDDK-tagged (più di 0,6 mg di proteina/mL) e alta specificità, è raccomandato luso per la co-immunoprecipitazione e la purificazione delle proteine.

Proprietà

Conservazione (dalla data di ricezione)

Protocollo

Preparazione delle microsfere magnetiche
1. Sospendere le microsfere magnetiche Anti-DYKDDDDK Tag nel flacone (pipettare delicatamente per 10 volte, non vortexare). Trasferire 10 µL (la quantità può essere aumentata o diminuita secondo necessità) di sospensione di microsfere magnetiche Anti-DYKDDDDK Tag in una nuova provetta.
2. Aggiungere 0,5 mL di tampone TBS (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4). Pipettare delicatamente per 5 volte le microsfere magnetiche Anti-DYKDDDDK Tag. Posizionare la provetta sul magnete per separare le microsfere dalla soluzione per 1-2 min (può essere opportunamente esteso a 5 minuti) e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio per 2 volte.
Nota: Preparare tutte le microsfere magnetiche insieme in un tubo grande e poi dividerle in aliquote se i campioni sono in batch. Durante la rimozione del surnatante, aspirare delicatamente, poiché uneccessiva aspirazione può causare la perdita di alcune microsfere magnetiche.
Legame proteico
3. Aggiungere 500 µL di lisato cellulare alle microsfere magnetiche lavate. Ruotare delicatamente la provetta per 2 ore a temperatura ambiente o per tutta la notte a 4°C.
4. Posizionare la provetta sul magnete per separare le microsfere dalla soluzione per 1-2 min (può essere opportunamente esteso) e quindi trasferire il surnatante in una nuova provetta per rilevare se la proteina DYKDDDDK-tag è residua.
Nota: Durante il processo di legame, non influirà sul risultato se le microsfere magnetiche si raggruppano occasionalmente.
Lavaggio magnetico
5. Aggiungere 500 µL di PBST alla provetta (NaCl 136,89 mM; KCl 2,67 mM; Na2HPO4 8,1 mM; KH2PO4 1,76 mM; 0,5% Tween20), risospendere le microsfere magnetiche pipettando delicatamente. Quindi ruotare la provetta per 5 min. Posizionare la provetta sul magnete per separare le microsfere dalla soluzione per 10 sec e rimuovere il surnatante.
6. Ripetere il passaggio 5 per circa 2 volte. Se rimangono proteine di impurità non specifiche, prolungare il tempo di pulizia, aumentare i tempi di pulizia o aumentare correttamente il contenuto di detergente nella soluzione di pulizia.
Eluizione e rilevazione
Scegliere diversi metodi di eluizione in base alluso a valle. Per lIP, andare al passaggio 7-8. Per la purificazione delle proteine, andare al passaggio 9-10 per leluizione a basso pH.
Eluizione denaturante (adatta per esperimenti di IP utilizzando microsfere Anti-DYKDDDDK Tag):
7. Per la rilevazione diretta delle proteine target, aggiungere 50 µL di tampone di caricamento del campione 1×proteina nella precipitazione sopra menzionata, bollire per 5 min, raffreddare a temperatura ambiente e quindi posizionare la provetta sul magnete per separare le microsfere dalla soluzione per 1-2 min (può essere opportunamente esteso).
8. Rilevare il surnatante mediante SDS-PAGE.
Eluizione competitiva del polipeptide poli DYKDDDDK Tag (adatta per purificazioni proteiche con microsfere Anti-DYKDDDDK Tag):
9. Aggiungere il tampone TBS con 200 µg-1 mg/mL di peptide poli DYKDDDDK Tag (B23111) al prodotto del passaggio 6, e quindi incubarli su agitatore (4°C) per 2 h. Generalmente, il volume del peptide poli DYKDDDDK Tag è 5 volte quello del gel.
10. Posizionare i prodotti del passaggio precedente sulla separazione magnetica per la separazione magnetica. Trasferire il surnatante contenente la proteina target in una nuova provetta EP. Se è necessario riutilizzare le microsfere magnetiche, pulire il gel con 0,1 M glicina HCl (pH 3,0) ed effettuare il riciclo.
Eluizione a basso pH (adatta per la purificazione delle proteine con microsfere Anti-DYKDDDDK Tag):
11. Aggiungere il tampone di eluizione 0,1 M glicina HCl (pH 3,0) al prodotto del passaggio 6, e incubare su agitatore per 5 min (Il tempo di eluizione dovrebbe essere inferiore a 20 min). Generalmente, il volume del tampone di eluizione è 5 volte quello del gel.
12. Centrifugare i prodotti ottenuti dal passaggio precedente a 5000 rpm per 30 sec. Quindi trasferire rapidamente il prodotto di eluizione in 1 M Tris (pH 8,0) per la neutralizzazione fino a quando il pH è quasi neutro.

Risoluzione dei problemi

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