Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Materiali richiesti (non inclusi)

• lettore di micropiastre (filtro da 450 nm)
• 10 μl, 100-200 μl e pipette multicanale.
• 1 % SDS (opzionale).

Procedura sperimentale

1) Inoculare le cellule in un matraccio o una capsula di coltura cellulare e lasciare che le cellule aderiscano o crescano per circa 4-24 ore prima di procedere con il saggio.
2) Aggiungere 1/10 del volume di Cell Counting Kit-8 (CCK-8) direttamente alle cellule nel mezzo di coltura. Mescolare accuratamente per ottenere una soluzione omogenea picchiettando leggermente lesterno della piastra più volte, evitando la formazione di bolle. Per una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 10 µl di Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per 100 µl di mezzo di coltura.
3) Incubare in un incubatore per colture cellulari per 0,5-4 ore a 37°C finché il colore non diventa arancione. Unincubazione eccessiva darà risultati falsi.
Nota: La sensibilità di rilevamento aumenta con tempi di incubazione più lunghi. Per campioni con meno cellule, utilizzare un tempo di incubazione più lungo, fino a 24 ore.
4) Registrare i risultati utilizzando un lettore di micropiastre per misurare lassorbanza del Cell Counting Kit-8 (CCK-8) a 450 nm. I valori DO raccomandati sono compresi tra 0,8 e 1,5, tuttavia valori compresi tra 0,5 e 2,5 sono accettabili.
Nota: Una leggera assorbanza spontanea intorno a 450 nm si verifica nel mezzo di coltura incubato con Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Questa assorbanza di fondo dipende dal mezzo di coltura, dal pH, dal tempo di incubazione e dalla durata dellesposizione alla luce. Lassorbanza di fondo tipica dopo 2 ore di incubazione è di 0,1-0,2 unità di assorbanza. Per correggere ciò, preparare uno o più pozzetti di controllo senza cellule e sottrarre lassorbanza media dei pozzetti di controllo da quella degli altri pozzetti.
5) Opzionale: Aggiungere 10 μl di SDS all1 % (sciogliere 0,1 g di SDS con tampone PBS per preparare 10 ml di soluzione) direttamente a 100 μl di cellule per arrestare la reazione. I segnali possono essere letti entro 3 giorni senza alterare i valori di assorbanza.
6) Calcolo della vitalità cellulare:
Vitalità cellulare (%)
A (Farmaco+): valore DO dei pozzetti con cellule, CCK-8 e farmaci;
A (Farmaco-): valore DO dei pozzetti con cellule, CCK-8, ma senza farmaci;
A (Bianco): valore DO dei pozzetti con mezzo di coltura e CCK-8, ma senza cellule.

Breve riassunto del protocollo

Applicazioni

1) Determinazioni della proliferazione cellulare: il Selleck Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è idrosolubile, stabile in coltura e non tossico.
2) Saggi di vitalità cellulare: lattività metabolica e la generazione di colorante cambiano in proporzione alla vitalità alterata.
3) Saggi delle citochine: misurano la proliferazione indotta dalle citochine. Le cellule possono essere recuperate ed espanse alla fine dello studio, se desiderato.
4) Saggi di citotossicità: la morte cellulare dovuta a sostanze chimiche citotossiche non ha effetti sullo sviluppo del colore; solo le cellule viventi convertono il reagente in un indicatore colorimetrico. Il reagente stesso ha una tossicità trascurabile ed è generalmente sicuro per le cellule.

Nota

1. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) è una soluzione pronta alluso. Mescolare il reagente per garantire una soluzione omogenea prima delluso.
2. Se si prevede di utilizzare un tempo di incubazione più lungo (durante la notte), assicurarsi di mantenere condizioni sterili durante laggiunta del reagente e lincubazione per evitare contaminanti microbici. Le colture contaminate daranno risultati errati poiché i contaminanti microbici riducono anche il Cell Counting Kit-8 (CCK-8).
3. Assicurarsi di includere controlli di saggio appropriati. Per ridurre al minimo gli errori sperimentali, si consiglia di effettuare misurazioni da un minimo di 3-8 replicati del controllo sperimentale e del controllo solo con il mezzo.
4. Questo prodotto è solo per uso di ricerca e sviluppo, non per usi medici, domestici o altri.