WYE-687

N. catalogoS2668 Lotto:S266801

Dati tecnici

Formula	C₂₈H₃₂N₈O₃
Peso molecolare	528.61	Numero CAS	1062161-90-3
Solubilità (25°C)*	In vitro	5%TFA	3.04 mg/mL (5.75 mM)
		DMSO	0.5 mg/mL (0.94 mM)
		Water	Insoluble
* <1 mg/ml significa leggermente solubile o insolubile. * Si prega di notare che Selleck testa la solubilità di tutti i composti internamente e la solubilità effettiva può differire leggermente dai valori pubblicati. Ciò è normale ed è dovuto a leggere variazioni da lotto a lotto. * Spedizione a temperatura ambiente (I test di stabilità mostrano che questo prodotto può essere spedito senza alcuna misura di raffreddamento.)

Preparazione delle soluzioni stock

Attività biologica

Descrizione

WYE-687 è un inibitore ATP-competitivo e selettivo di mTOR con IC50 di 7 nM; questo composto blocca mTORC1/pS6K(T389) e mTORC2/P-AKT(S473) ma non si osserva alcun effetto su P-AKT(T308). La selettività per mTOR è maggiore rispetto a PI3Kα (>100 volte) e PI3Kγ (>500 volte).

Target

mTOR

7 nM

In vitro

Il saggio chinasico in complesso immune mostra che il substrato His6-AKT specifico di mTORC2 o il substrato His6-S6K di mTORC1 sono inibiti in modo dose-dipendente da WYE-687. Questo composto inibisce globalmente la segnalazione di mTOR e la funzione di AKT in modelli cellulari in modo dose-dipendente. Inibisce profondamente la sintesi proteica cap-dipendente e globale nelle cellule MDA361, cellule di carcinoma mammario umano. Questa sostanza chimica mostra effetti antiproliferativi in varie linee cellulari tumorali che coinvolgono l'arresto del ciclo cellulare in fase G1 e l'apoptosi selettiva. Down-regola i fattori angiogenici, VEGF e HIF-1α, nelle cellule U87MG, MDA361 e LNCap.

Protocollo (da riferimento)

Saggio della chinasi:^{^[1]}	Formato DELFIA di FLAG-TOR purificato I saggi di routine con FLAG-TOR purificato (FL e 3.5) vengono eseguiti in piastre a 96 pozzetti come segue. Gli enzimi vengono prima diluiti in tampone di saggio chinasico (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 μM microcistina LR e 100 μg/mL BSA). In ciascun pozzetto, 12 μL dell'enzima diluito vengono mescolati brevemente con 0.5 μL di inibitore di prova o veicolo di controllo dimetilsolfossido (DMSO). La reazione chinasica viene avviata aggiungendo 12.5 μL di tampone di saggio chinasico contenente ATP e His6-S6K per ottenere un volume di reazione finale di 25 μL contenente 800 ng/mL di FLAG-TOR, 100 μM di ATP e 1.25 μM di His6-S6K. La piastra di reazione viene incubata per 2 ore (lineare a 1-6 ore) a temperatura ambiente con leggera agitazione e quindi terminata aggiungendo 25 μL di tampone di arresto (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA e 20 mM EGTA). La rilevazione DELFIA del His6-S6K fosforilato (Thr-389) viene eseguita a temperatura ambiente utilizzando un anticorpo monoclonale anti-P(T389)-p70S6K (1A5) etichettato con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu per anticorpo). Quarantacinque microlitri della miscela di reazione chinasica terminata vengono trasferiti in una piastra MaxiSorp contenente 55 μL di PBS. Il His6-S6K viene lasciato attaccare per 2 ore, dopodiché i pozzetti vengono aspirati e lavati una volta con PBS. Vengono aggiunti cento microlitri di tampone DELFIA con 40 ng/mL di anticorpo Eu-P(T389)-S6K. Il legame dell'anticorpo viene continuato per 1 ora con delicata agitazione. I pozzetti vengono quindi aspirati e lavati quattro volte con PBS contenente 0.05% di Tween 20 (PBST). Vengono aggiunti cento microlitri di soluzione di potenziamento DELFIA a ciascun pozzetto e le piastre vengono lette in un lettore di piastre modello PerkinElmer Victor. I dati ottenuti vengono utilizzati per calcolare l'attività enzimatica e l'inibizione enzimatica da parte di potenziali inibitori.
Saggio cellulare:^{^[1]}	Linee cellulari MDA361, U87MG, HCT116, LNCap and HT29 cells Concentrazioni 0-100 μM Tempo di incubazione 24 or 48 hours Metodo For cell cycle analysis, cells are seeded in 96-well culture plates at 10,000 cells per well for 24 hours, treated with various inhibitors for 24 hours or 48 hours. Following treatment, cells are harvested, washed with PBS and fixed overnight at -20 °C in 70% ethanol. Cells are washed, stained with propidium iodide and analyzed for cell cycle profile (acquired 5000 cells/well) on Guava PCA-96 instrument according to the Guava Cell Cycle Protocol

Saggio della chinasi:^{^[1]}

Formato DELFIA di FLAG-TOR purificato
I saggi di routine con FLAG-TOR purificato (FL e 3.5) vengono eseguiti in piastre a 96 pozzetti come segue. Gli enzimi vengono prima diluiti in tampone di saggio chinasico (10 mM Hepes (pH 7.4), 50 mM NaCl, 50 mM β-glicerofosfato, 10 mM MnCl₂, 0.5 mM DTT, 0.25 μM microcistina LR e 100 μg/mL BSA). In ciascun pozzetto, 12 μL dell'enzima diluito vengono mescolati brevemente con 0.5 μL di inibitore di prova o veicolo di controllo dimetilsolfossido (DMSO). La reazione chinasica viene avviata aggiungendo 12.5 μL di tampone di saggio chinasico contenente ATP e His6-S6K per ottenere un volume di reazione finale di 25 μL contenente 800 ng/mL di FLAG-TOR, 100 μM di ATP e 1.25 μM di His6-S6K. La piastra di reazione viene incubata per 2 ore (lineare a 1-6 ore) a temperatura ambiente con leggera agitazione e quindi terminata aggiungendo 25 μL di tampone di arresto (20 mM Hepes (pH 7.4), 20 mM EDTA e 20 mM EGTA). La rilevazione DELFIA del His6-S6K fosforilato (Thr-389) viene eseguita a temperatura ambiente utilizzando un anticorpo monoclonale anti-P(T389)-p70S6K (1A5) etichettato con Europio-N1-ITC (Eu) (10.4 Eu per anticorpo). Quarantacinque microlitri della miscela di reazione chinasica terminata vengono trasferiti in una piastra MaxiSorp contenente 55 μL di PBS. Il His6-S6K viene lasciato attaccare per 2 ore, dopodiché i pozzetti vengono aspirati e lavati una volta con PBS. Vengono aggiunti cento microlitri di tampone DELFIA con 40 ng/mL di anticorpo Eu-P(T389)-S6K. Il legame dell'anticorpo viene continuato per 1 ora con delicata agitazione. I pozzetti vengono quindi aspirati e lavati quattro volte con PBS contenente 0.05% di Tween 20 (PBST). Vengono aggiunti cento microlitri di soluzione di potenziamento DELFIA a ciascun pozzetto e le piastre vengono lette in un lettore di piastre modello PerkinElmer Victor. I dati ottenuti vengono utilizzati per calcolare l'attività enzimatica e l'inibizione enzimatica da parte di potenziali inibitori.

Saggio cellulare:^{^[1]}

Linee cellulari
MDA361, U87MG, HCT116, LNCap and HT29 cells
Concentrazioni
0-100 μM
Tempo di incubazione
24 or 48 hours
Metodo
For cell cycle analysis, cells are seeded in 96-well culture plates at 10,000 cells per well for 24 hours, treated with various inhibitors for 24 hours or 48 hours. Following treatment, cells are harvested, washed with PBS and fixed overnight at -20 °C in 70% ethanol. Cells are washed, stained with propidium iodide and analyzed for cell cycle profile (acquired 5000 cells/well) on Guava PCA-96 instrument according to the Guava Cell Cycle Protocol

Riferimenti

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=WYE-687

Convalida del prodotto da parte del cliente

: , , J Hepatol, 2016, 64(3):609-17.

Sellecks WYE-687 È stato citato da 1 Pubblicazione

Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche [Govaere O, et al. J Hepatol, 2015, 10.1016/j.jhep.2015.11.011]	PubMed: 26592953

Laminin-332 sustains chemoresistance and quiescence as part of the human hepatic cancer stem cell niche [Govaere O, et al. J Hepatol, 2015, 10.1016/j.jhep.2015.11.011]

PubMed: 26592953

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