Wortmannin (SL-2052)

L'inibizione di MLCK da parte della Wortmannina non è influenzata dalla calmodulina o dal substrato peptidico, mentre è ridotta da un'alta concentrazione di ATP. Questo composto interagisce direttamente con il dominio catalitico di MLCK e porta a una perdita irreversibile dell'attività enzimatica. Non ha effetti inibitori sulla proteina chinasi cAMP-dipendente, sulla proteina chinasi cGMP-dipendente e sulla proteina chinasi II calmodulina-dipendente, e ha scarso effetto sull'attività della proteina chinasi C. [1]

Questo inibitore inibisce la formazione di PtdInsP3 (fosfatidilinositolo 3,4,5-trifosfato) stimolata da N-formilmetionil-leucilfenilalanina (fMLP) con IC50 di 5 nM e questa inibizione è completamente abolita se pretrattata con 100 nM di questo composto in neutrofili umani, con livelli aumentati di PtdInsP2 e nessun effetto sui contenuti cellulari di PtdInsP e PtdIns. Potrebbe sviluppare cambiamenti oscillatori nel contenuto di F-actina e non inibisce la polimerizzazione dell'actina stimolata da fMLP nei neutrofili. [2]

Questa sostanza chimica inibisce irreversibilmente l'attività della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3-chinasi) legandosi alla proteina da 110 kDa (IC50 di 3 nM) e non ha alcun effetto sulla PI4-chinasi nelle cellule RBL-2H3. Inibisce anche il rilascio di leucotrieni, senza alcun effetto sull'attivazione della tirosin chinasi Lyn. [3]

Questo composto abolisce completamente l'assorbimento indotto di esosi negli adipociti di ratto isolati a 0,1 μM, senza compromettere l'attività lipolitica stimolata. [4]

Sopprime la produzione indotta di ossido nitrico del 50% a 500 nM nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana, in risposta all'IGF-1. [5]

Questa sostanza chimica sopprime la riparazione delle rotture a doppio filamento del DNA (DSB) e non ha alcun effetto sui livelli di DSB o sulla cinetica della riparazione delle rotture a singolo filamento (SSB) nelle cellule di ovaio di criceto cinese a 50 μM. Potrebbe potenziare la citotossicità indotta da radiazioni ionizzanti (IR) senza tossicità propria. [6]

Questo inibitore inibisce l'attività della polo-like chinasi (PLK1) con IC50 di 24 nM in cellule intatte arrestate in G2/M. [7]

Aumenta l'accumulo mediato dal recettore Toll-like (TLR) di IL-6 nei macrofagi umani con EC50 di 50 nM. Nel frattempo, questo composto migliora significativamente l'espressione di ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) mediata da TLR e l'accumulo di nitrito nei macrofagi di topo. Attiva il fattore nucleare-κB e sovraregola la produzione di mRNA di citochine. [8]

Questa sostanza chimica inibisce anche la Polo-like chinasi (PlK) 1 e PlK3, che svolgono ruoli importanti nella mitosi. Il suo trattamento potrebbe portare a una riduzione della fosforilazione di p53 sulla serina 20 indotta dal danno al DNA. [9]

Sopprime la fosforilazione di Akt indotta dall'ialuronano e la motilità/migrazione cellulare nelle cellule SW1990. [10]

La Wortmannina inibisce la metastasi peritoneale di SW1990 nei topi a 1 mg/kg, senza alcuna perdita di peso. [10]

Questo composto inibisce la fosforilazione della fosfatidilinositide 3-chinasi-proteina chinasi B (PKB)/Akt sia nei tessuti normali (omogenati di polmone, cuore e cervello) che nel tessuto tumorale nei topi, senza mortalità o tossicità acuta a 0,7 mg/kg. In combinazione con LY188011, questa sostanza chimica aumenta significativamente l'apoptosi e inibisce la crescita tumorale nel tumore ortotopico, mentre entrambe le monoterapie non sono riuscite. [11]

• Saggio MLCK

  L'attività MLCK viene saggiata con substrato peptidico (KKRPQRATSNVFS-NH₂) o catena leggera della miosina. Il substrato peptidico (24 μM) viene fosforilato in una miscela di reazione contenente 25 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 0,5 mg/mL di albumina sierica bovina, 4 mM di MgCl₂, 0,5 mM di CaCl₂, 2,6 nM di calmodulina, 1,5 nM di MLCK e 400 μM di ATP in un volume finale di 0,25 mL. Dopo una preincubazione di 10 minuti a 28 °C senza ATP, la reazione viene avviata con l'aggiunta di ATP a 28 °C e terminata con l'aggiunta di 0,1 mL di acido acetico al 10% (v/v) dopo 30 minuti. La miscela viene analizzata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni: colonna, Unisil Pack 5C18 4,6 X 150 mm; solvente, 18% (v/v) di acetonitrile, 0,1% (v/v) di acido trifluoroacetico in acqua; velocità di flusso, 1,0 mL/min; temperatura, 40 °C; rilevamento, assorbanza a 220 nm. La percentuale di reazione viene calcolata dal rapporto delle aree dei picchi della forma fosforilata rispetto a quelle della forma non fosforilata. L'attività specifica misurata nelle condizioni sopra descritte è di 0,81 μmol/min/mg. La catena leggera della miosina (108 μg/mL) viene fosforilata in una miscela di reazione contenente 25 mM Tris-HC1 (pH 7,5), 0,5 mg/mL di albumina sierica bovina, 4 mM di MgCl₂, 0,5 mM di CaCl₂, 4,2 nM di calmodulina, 0,92 nM di enzima e 10 μM di [γ-³²P]ATP (100-900 cpm/pmol) in un volume finale di 0,25 mL. Dopo una preincubazione di 3 minuti a 30 °C senza ATP, la reazione viene avviata con l'aggiunta di [γ-³²P]ATP a 30 °C e interrotta con l'aggiunta di 0,125 mL di acido tricloroacetico dopo 5 minuti. I materiali precipitabili con acido vengono raccolti su un filtro a membrana di nitrocellulosa e lavati con quattro aliquote di 1 mL di acido tricloroacetico al 5% (v/v). La radioattività sul filtro viene misurata in un fluido di scintillazione al toluene, utilizzando uno spettrometro a scintillazione liquida Packard Tri-Carb modello 4530. L'attività specifica misurata in queste condizioni è di 1,23 μmol/min/mg. [1]

• Linee cellulari

  NK cells

• Concentrazioni

  1 μM

• Tempo di incubazione

  1 h

• Metodo

  Primary NK cells were pretreated with wortmannin (1 μM) for 1 h, washed twice with RPMI 1640, and then treated with IL-15 (10 ng/mL) for 24 h. DMSO was used as control.

• Modelli animali

  Human pancreatic adenocarcinoma cells PK1 are injected both s.c. and orthotopically into SCID mice.

• Dosaggi

  0.175, 0.35, and 0.7 mg/kg

• Somministrazione

  Injected by i.v.