Volasertib (BI6727)

Come BI2536, BI6727 è un inibitore chinasico ATP-competitivo appartenente alla classe dei composti diidropteridinoni. Oltre a Plk1, questo composto inibisce potentemente anche due chinasi strettamente correlate, Plk2 e Plk3, con IC50 di 5 nM e 56 nM, rispettivamente. Questa sostanza chimica a concentrazioni fino a 10 μM non mostra alcuna attività inibitoria contro un pannello di >50 altre chinasi. Inibisce la proliferazione di più linee cellulari derivate da vari tessuti tumorali, tra cui le cellule HCT116, NCI-H460, BRO, GRANTA-519, HL-60, THP-1 e Raji con EC50 di 23 nM, 21 nM, 11 nM, 15 nM, 32 nM, 36 nM e 37 nM, rispettivamente. Questo trattamento composto (100 nM) nelle cellule NCI-H460 induce un accumulo di cellule mitotiche con fusi monopolari e una colorazione positiva per l'istone H3 fosfoserina 10, confermando che le cellule sono arrestate precocemente nella fase M, seguito dall'induzione dell'apoptosi. [1] Basse concentrazioni nanomolari di questo inibitore mostrano una potente attività inibitoria contro le cellule staminali tumorali di neuroblastoma (NB TIC) con EC50 di 21 nM, mentre solo concentrazioni micromolari di esso sono citotossiche per le normali cellule staminali neurali pediatriche. [2] Induce l'arresto della crescita delle cellule di medulloblastoma Daoy e ONS-76 in modo simile a BI 2536. [3]

La somministrazione di BI6727 inibisce significativamente la crescita di numerosi xenotrapianti di carcinoma umano, inclusi HCT116, NCI-H460 e carcinoma del colon CXB1 resistente al taxano, accompagnata da un aumento dell'indice mitotico e da un aumento dell'apoptosi. [1] Negli studi in vivo, questo composto mostra un migliore profilo di tossicità e farmacocinetico rispetto a BI2536. [3]

• Saggi chinasici in vitro

  La Plk1 umana ricombinante (residui 1-603) è espressa come proteina di fusione marcata con GST all'estremità NH₂ utilizzando un sistema di espressione baculovirale e purificata mediante cromatografia di affinità utilizzando glutatione-agarosio. I saggi di attività enzimatica per Plk1 vengono eseguiti in presenza di questo composto diluito in serie utilizzando 20 ng di chinasi ricombinante e 10 μg di caseina da latte bovino come substrato. Le reazioni chinasiche vengono eseguite in un volume finale di 60 μL per 45 minuti a 30 °C [15 mM MgCl₂, 25 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM DTT, 1% DMSO, 7.5 μM ATP, 0.3 μCi γ-³²P-ATP]. Le reazioni vengono terminate mediante l'aggiunta di 125 μL di TCA al 5% ghiacciato. Dopo aver trasferito i precipitati su piastre filtranti in cellulosa a esteri misti MultiScreen, le piastre vengono lavate con TCA all'1% e quantificate radiometricamente. Le curve dose-risposta vengono utilizzate per calcolare il valore di IC50.

• Linee cellulari

  HCT116, NCI-H460, BRO, GRANTA-519, HL-60, THP-1, and Raji

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~1 μM

• Tempo di incubazione

  24, 48, and 72 hours

• Metodo

  Cell proliferation assays are done by incubating cells in the presence of various concentrations of this compound for 24, 48, and 72 hours and cell growth is assessed by measuring Alamar blue dye conversion in a fluorescence spectrophotometer. Effective concentrations at which cellular growth is inhibited by 50% (EC50) are extrapolated from the dose-response curve fit. To determine the DNA content, cell suspensions are fixed in 80% ethanol, treated for 5 minutes with 0.25% Triton X-100 in PBS, and incubated with 0.1% RNase and 10 μg/mL propidium iodide in PBS for 20 minutes at room temperature. Cell cycle profiles are determined by flow cytometric analysis.

• Modelli animali

  Female BomTac:NMRI-Foxn1^nu mice grafted s.c. with HCT116, NCI-H460, or CXB1 cells

• Dosaggi

  ~25 mg/kg/day

• Somministrazione

  Injected i.v., or given intragastrally via gavage needle