Vadimezan (DMXAA)

L'attività dell'enzima DT-diaphorase purificata viene saggiata misurando la riduzione del citocromo c a 550 nm su uno spettrofotometro Beckman DU 650. Ogni saggio contiene citocromo c (70 μM), NADH (concentrazioni variabili), DT-diaphorase purificata (0,032 μg) e menadione (concentrazioni variabili) in un volume finale di 1 mL di tampone Tris–HCl (50 mM, pH 7,4) contenente 0,14% di BSA. La reazione viene avviata con l'aggiunta di NADH. I tassi di riduzione vengono calcolati sulla parte iniziale della curva di reazione (30 secondi) e i risultati sono espressi in termini di μmol di citocromo c ridotto/min/mg di proteina utilizzando un coefficiente di estinzione molare di 21,1 mM⁻¹ cm⁻¹ per il citocromo c ridotto. I saggi enzimatici vengono eseguiti a temperatura ambiente e tutte le reazioni sono eseguite in triplicato. L'inibizione dell'attività della DT-diaphorase purificata viene eseguita includendo Vadimezan (DMXAA) a varie concentrazioni nella reazione, e le caratteristiche di inibizione sono determinate variando la concentrazione di NADH (menadione costante) o menadione (NADH costante) a diverse concentrazioni di questo composto. I valori di K_i si ottengono tracciando 1/V contro. L'attività della DT-diaphorase nelle cellule DLD-1 è determinata misurando la riduzione dicumarolo-sensibile del DCPIP a 600 nm. Brevemente, le cellule DLD-1 in fase di crescita esponenziale media vengono raccolte per raschiamento in tampone freddo (Tris–HCl, 25 mM, pH 7,4 e 250 mM saccarosio) e sonicato su ghiaccio. Le condizioni del saggio enzimatico sono 2 mM NADH, 40 μM DCPIP, 20 μL di dicumarolo (quando richiesto) in un volume finale di 1 mL di Tris–HCl (25 mM, pH 7,4) contenente BSA (0,7 mg/mL). I risultati sono espressi come la riduzione dicumarolo-sensibile del DCPIP utilizzando un coefficiente di estinzione molare di 21 mM⁻¹ cm⁻¹. I livelli di proteine sono determinati utilizzando il saggio di Bradford.

DLD-1 and H460 cells

0-2 mM

96 hours

DLD-1 human colon carcinoma and H460 human non-small cell lung carcinoma cells are routinely maintained as monolayer cultures in RPMI 1640 culture medium supplemented with foetal calf serum (10%), sodium pyruvate (2 mM), penicillin/streptomycin (50 IU mL⁻¹/50 μg mL^-1) and l-glutamine (2 mM). Chemosensitivity is assessed using the MTT assay and all assays are performed under aerobic conditions. Briefly, cells are plated into each well of a 96-well culture plate and incubated overnight in an atmosphere containing 5% CO₂. Culture medium is completely removed from each well and replaced with medium containing a range of drug concentrations. In the case of menadione alone, the duration of drug exposure is 1 hour, after which the cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of 200 μL fresh RPMI 1640 medium to each well of the plate. For Vadimezan (DMXAA) alone, the duration of exposure is 3 hours. Following a four-day incubation, cell survival is determined using the MTT assay. For combinations of this compound with menadione, cells are initially set up and a non-toxic (>95% cell survival) concentration of it is selected. Cells are then initially exposed to DMXAA (2 mM) for a period of 2 hours, following which the medium is removed and replaced with medium containing the inhibitor (at a constant concentration of 2 mM) and menadione (at a range of drug concentrations). Following a further 7-hour incubation, cells are washed twice with Hanks' balanced salt solution prior to the addition of growth medium.

Chemical carcinogen (NMU) is injected into female Wistar rats.

≤300 mg/kg

Administered via i.p.