UNC1999

I saggi di attività della metiltransferasi vengono eseguiti monitorando l'incorporazione del gruppo metilico marcato con trizio da S-adenosilmetionina (3H-SAM) a substrati peptidici biotinilati utilizzando il Saggio di Prossimità a Scintillazione (SPA) per il complesso trimerico PRC2-EZH2 (EZH2:EED:SUZ12), il complesso pentamerico PRC2-EZH1 (EZH1:EED:SUZ12:RBBP4:AEBP2), SETD7, G9a, GLP, SETDB1, SETD8, SUV420H1, SUV420H2, SUV39H2, il complesso tetramerico MLL1 (MLL:WDR5:RbBP5:ASH2L), PRMT1, PRMT3, il complesso PRMT5-MEP50 e SMYD2. Il tampone di reazione per SMYD2 e SMYD3 è 50 mM Tris pH 9.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100; per G9a, GLP e SUV39H2 è 25 mM fosfato di potassio pH 8.0, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl₂ e 0.01% Triton X-100; e per altre HMT 20 mM Tris pH 8.0, 5 mM DTT, 0.01% TritonX-100. Per arrestare le reazioni enzimatiche, vengono aggiunti 10 μL di guanidina cloridrato 7.5 M, seguiti da 180 μL di tampone, miscelati e trasferiti in una FlashPlate a 384 pozzetti. Dopo la miscelazione, le miscele di reazione vengono incubate e i conteggi CPM vengono misurati utilizzando un lettore di piastre Topcount. I conteggi CPM in assenza di questo composto per ogni set di dati sono definiti come attività al 100%. In assenza dell'enzima, i conteggi CPM in ogni set di dati sono definiti come sfondo (0%). I valori di IC50 vengono determinati utilizzando concentrazioni di composto che vanno da 100 nM a 100 μM. I valori di IC50 vengono determinati utilizzando il software SigmaPlot. I saggi EZH2-Y641F vengono eseguiti utilizzando 30 nM di enzima in 20 mM Tris pH 8, 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100, 5 μM SAM e 1 μM di peptide H3 (1-24) (lo stesso che per il complesso PRC2-EZH2 di tipo selvatico). Per DNMT1, il saggio viene eseguito utilizzando dsDNA emimetilato come substrato. Il substrato di dsDNA viene preparato mediante annealing di due filamenti complementari (filamento avanti biotinilato: BGAGCCCGTAAGCCCGTTCAGGTCG e filamento inverso: CGACCTGAACGGGCTTACGGGCTC), sintetizzati da Eurofins MWG Operon. Il tampone di reazione è 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5mM DTT, 0.01% Triton X-100. I saggi di attività della metiltransferasi per DOT1L vengono eseguiti utilizzando piastre filtranti. Le miscele di reazione in 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM DTT, 2 mM MgCl₂ e 0.01% Triton X-100 vengono incubate a temperatura ambiente per 1h, vengono aggiunti 100 μL di TCA al 10%, miscelati e trasferiti in una piastra filtrante. Le piastre vengono centrifugate a 2000 rpm per 2 min seguite da 2 ulteriori lavaggi con TCA al 10% e un lavaggio con etanolo (180 μL) seguito da centrifugazione. Le piastre vengono essiccate e vengono aggiunti 100 μL di MicroO e centrifugate. Vengono aggiunti 70 μL di MicroO e i CPM vengono misurati utilizzando un lettore di piastre Topcount.

DLBCL cell line harboring the EZH2Y641N mutant

~5 μM

8 days

DB cells, a diffuse-large B-cell lymphoma cell line harboring the EZH2 Y641N mutation, are obtained from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum, antibiotics, and various concentrations of compounds (DMSO control, UNC1999, or UNC2400). The medium containing the test compound or control is refreshed every 3 days. The numbers of viable cells from at least three independent experiments are measured using TC20 automated cell counter system. Total histones are prepared from cell nuclei using an acidic extraction protocol. About 1 μg of total histones is separated using 15% SDS-PAGE, transferred to PVDF membranes, and probed with histone antibodies. Antibodies used in this study are those against EZH2, general H3, and H3K27me3.

Male Swiss albino mice

~150 mg/kg (i.p.), ~50 mg/kg (oral)

Intraperitoneal administration or oral administration