Ulixertinib (BVD-523)

La proteina ERK2 attivata da MEK U911 è espressa e purificata internamente. Le soluzioni di enzima e substrato sono preparate in un tampone di saggio costituito da 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 10 mM DTT e 0,01% (v/v) CHAPS. 1,2 nM di proteina ERK2 sono preparati nel tampone di saggio e 10 µL vengono dispensati in ciascun pozzetto di una piastra in polipropilene a 384 pozzetti contenente i composti di controllo di test e di riferimento, incluso Ulixertinib (BVD-523). Le piastre di composti erano state precedentemente dosate con un intervallo di 12 punti da 100 µM a 0,1 nM al fine di calcolare le loro IC50, con una concentrazione totale di DMSO nel saggio dell'1%. Dopo una pre-incubazione di 20 minuti di enzima e composto a temperatura ambiente, vengono aggiunti 10 µL di soluzione di substrato consistente in 16 µM di Erktide (IPTTPITTTYFFFK) e 120 µM di ATP (Km misurato) nel tampone di saggio. La reazione è lasciata progredire per 20 minuti a temperatura ambiente prima di essere interrotta dall'aggiunta di 80 µl di acido formico all'1% (v/v). Le piastre del saggio vengono quindi analizzate sulla piattaforma di spettrometria di massa RapidFire per misurare i livelli di substrato (Erktide non fosforilato) e prodotto (Erktide fosforilato).

A375 cells

~30 μM

72 h

A375 cells are cultured in cell media composed of DMEM, 10% (v/v) Foetal Calf Serum and 1% (v/v) L-Glutamine. After harvesting, cells are dispensed into black, 384-well Costar plates to give 200 cells per well in a total volume of 40 µL cell media, and are incubated overnight at 37°C, 90% relative humidity and 5% CO₂ in a rotating incubator. Ulixertinib (BVD-523), test compounds and reference controls are dosed directly into the cell plates, into the inner 308 wells, using a Labcyte Echo 555 acoustic dispenser. The cells are dosed over a 12 point range from 30 µM down to 0.03 nM in order to calculate compound IC50s, with a total DMSO concentration in the assay of 0.3%. The cell plates are then incubated for 72 hours at 37°C. Cells were fixed and stained by the addition of 20 µL 12% formaldehyde in PBS/A (4% final concentration) and 1:2000 dilution of Hoechst 33342, with a 30 minute room temperature incubation, and then washed with PBS/A. A cell count is performed on the stained cell plates using a Cellomics ArrayScanTM VTI imaging platform. A Day 0 cell plate is also fixed, stained and read to generate a cell count baseline for determining compound cytotoxic effects as well as anti-proliferative effects.