TPCA-1

In un saggio di trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza risolta nel tempo, TPCA-1 inibisce l'attività dell'IKK-2 umana con un IC50 di 17,9 nM. Inoltre, questo composto si dimostra competitivo con l'ATP. Inoltre, presenta valori di IC50 di 400 nM e 3600 nM rispettivamente contro IKK-1 e JNK3. Questa sostanza chimica inibisce la produzione di TNF-α, IL-6 e IL-8 in modo concentrazione-dipendente, esibendo valori di IC50 di 170, 290 e 320 nM, rispettivamente. [1] Inibisce la proliferazione delle cellule di glioma, così come la traslocazione nucleare di RelA (p65) indotta dal TNF e l'espressione genica di IL8 dipendente da NFκB. È importante sottolineare che questo composto inibisce l'espressione genica indotta dall'IFN, sopprimendo completamente l'espressione genica di MX1 e GBP1, pur avendo solo un effetto minore sull'espressione di ISG15. [2]

La somministrazione profilattica di TPCA-1 a 3, 10 o 20 mg/kg, i.p., due volte al giorno (b.i.d.), determina una riduzione dose-dipendente della gravità dell'artrite murina indotta da collagene (CIA). La significativa riduzione della gravità della malattia e il ritardo dell'insorgenza della malattia, derivanti dalla somministrazione di questo composto a 10 mg/kg, i.p., due volte al giorno (b.i.d.), sono paragonabili agli effetti del farmaco antireumatico, i.p., a giorni alterni. La localizzazione nucleare di p65, così come i livelli di IL-1beta, IL-6, TNF-alpha e interferone-gamma, sono significativamente ridotti nel tessuto della zampa dei topi trattati con questo composto. Inoltre, la somministrazione in vivo di questa sostanza chimica determina una significativa diminuzione della proliferazione delle cellule T indotta da collagene ex vivo. La somministrazione terapeutica di questo composto a 20 mg/kg, ma non a 3 o 10 mg/kg, i.p., due volte al giorno (b.i.d.), riduce significativamente la gravità della CIA. [1]

• Saggio IKK-2

  La IKK-2 umana ricombinante (residui 1-756) viene espressa in baculovirus come proteina di fusione marcata con GST N-terminale, e la sua attività viene valutata utilizzando un saggio di trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza risolta nel tempo. In breve, IKK-2 (5 nM finale) diluita in tampone di saggio (50 mM HEPES, 10 mM MgCl₂, 1 mM CHAPS, pH 7.4, con 1 mM DTT e 0.01% p/v BSA) viene aggiunta ai pozzetti contenenti varie concentrazioni di questo composto o veicolo DMSO (3% finale). La reazione viene avviata con l'aggiunta di substrato GST-IκBα (25 nM finale)/ATP (1 μM finale), in un volume totale di 30 μL. La reazione viene incubata per 30 min a temperatura ambiente, quindi terminata con l'aggiunta di 15 μL di EDTA 50 mM. Il reagente di rilevamento (15 μL) in tampone (100 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl e 0.1% p/v BSA) contenente l'anticorpo monoclonale antiphosphoserine-IκBα-32/36 12C2, marcato con chelato di europio W-1024, e un anticorpo anti-GST marcato con alloficocianina viene aggiunto, e la reazione viene ulteriormente incubata per 60 min a temperatura ambiente. Il grado di fosforilazione di GST-IκBα viene misurato come un rapporto tra il segnale di trasferimento di energia specifico a 665 nm e il segnale di europio di riferimento a 620 nm, utilizzando un lettore di piastre Packard Discovery.

• Linee cellulari

  U87, MT330, SJ-G2, and GBM6 human glioma lines

• Concentrazioni

  0-50 μM

• Tempo di incubazione

  3 days

• Metodo

  Ten microliters of MTT from stock solution (10 mg/mL) is added to each well of 96-well plates containing glioma cells and incubated at 37 °C for 2–4 h. Oxidized MTT is solubilized by adding 100 μL of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) in 0.01 N HCL, and plates are incubated at 37 °C for 4 h in a humidified chamber. Plates are read at 570 nm on a plate reader.

• Modelli animali

  Murine collagen-induced arthritis

• Dosaggi

  3, 10, or 20 mg/kg

• Somministrazione

  Administered via i.p. or b.i.d.