Tiplaxtinin (PAI-039)

Il saggio cromogenico viene avviato con l'aggiunta di Tiplaxtinin (PAI-039) (concentrazione finale 10-100 µM, concentrazione massima di DMSO 0,2%) a PAI-1 umano ricombinante (140 nM in tampone a pH 6,6). Dopo un'incubazione di 15 minuti a 25°C, vengono aggiunti 70 nM di t-PA umano ricombinante, e la combinazione di questo composto, PAI-1 e tPA viene incubata per altri 30 minuti. Dopo la seconda incubazione, viene aggiunto Spectrozyme tPA e l'assorbanza viene letta a 405 nm a 0 e 60 minuti. L'attività inibitoria relativa di PAI-1 è uguale all'attività residua di tPA nel trattamento con Tiplaxtinin/PAI-1. I trattamenti di controllo includono l'inibizione completa di tPA da parte di PAI-1 nel rapporto molare impiegato (2:1), e l'assenza di qualsiasi effetto su t-PA da solo. Il saggio immunofunzionale si basa sull'interazione non dissociabile da SDS tra tPA e PAI-1 attivo. Le piastre del saggio vengono rivestite con 100 µl di una soluzione di t-PA (10 µg/ml in TBS) e mantenute a 4 °C durante la notte. Questo composto viene sciolto in DMSO e diluito a una concentrazione finale di 1-100 µM come descritto sopra. Viene quindi incubato con PAI-1 umano (50 ng/ml) per 15 minuti, e un'aliquota di questa soluzione viene aggiunta alla piastra rivestita di t-PA per 1 ora. La soluzione viene aspirata dalla piastra, che viene quindi lavata con un tampone costituito da 0,05% Tween 20 e 0,1% BSA in TBS. Questo saggio rileva solo PAI-1 inibitorio attivo (non latente o substrato) legato alla piastra, e viene quantificato usando un anticorpo monoclonale contro PAI-1 umano (MA33B8). Una diluizione 1000X di MA33B8 viene aggiunta alla piastra e incubata per un'ora, aspirata e lavata. Viene aggiunto un anticorpo secondario costituito da un coniugato di fosfatasi alcalina IgG (H+L)-AP di capra anti-topo, incubato per un'ora, aspirato e lavato. Viene aggiunta un'aliquota di 100 µl di soluzione di fosfatasi alcalina, seguita dalla determinazione dell'assorbanza a 405 nm 60 minuti dopo. La quantificazione del PAI-1 attivo residuo legato a t-PA a varie concentrazioni viene utilizzata per determinare l'IC50 adattando i risultati a un programma logistico di dose-risposta, con l'IC50 definita come la concentrazione del composto necessaria per ottenere il 50% di inibizione dell'attività di PAI-1. La sensibilità del saggio è di 5 ng/ml di PAI-1 umano, come determinato da una curva standard che va da 0 a 100 ng/ml di PAI-1 umano.

T24, UM-UC-14, UROtsa, and HeLa cells

~50 μM

24 h

Briefly, cell lines, T24, UM-UC-14, UROtsa, and HeLa cells are plated in 96-well dishes in triplicate at 1 ?10³ cells per well and allowed to adhere for 24 hours. Subsequently, tiplaxtinin (PAI-039) is added to the wells and allowed to incubate at the indicated concentrations. Cellular proliferation is determined by CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay according to manufacturer's instructions at 24 hours, and its IC50 is determined in Graphpad Prism. Luminescence was measured using a FLUOstar OPTIMA Reader.

Rat with carotid thrombosis

1 mg/kg

p.o.