Tanespimycin (17-AAG)

Tanespimycin (17-AAG), un analogo della geldanamicina, mostra un'affinità di legame superiore a 100 volte per Hsp90 derivata da cellule tumorali con sovraespressione di HER-2 (BT474, N87, SKOV3 e SKBR3) o cellule di carcinoma mammario BT474 con valori di IC50 di 5-6 nM. [1] Questo composto provoca la degradazione di HER2, HER3, Akt e del recettore degli androgeni (AR) sia mutante che wild-type, portando all'arresto della crescita G1 RB-dipendente di cellule di cancro alla prostata come LNCaP, LAPC-4, DU-145 e PC-3 con valori di IC50 di 25-45 nM. [2] Oltre a indurre l'apoptosi delle cellule Ba/F3 trasformate con BCR-ABL wild-type con una IC50 di 5,2 μM, ha la capacità di indurre l'apoptosi delle cellule trasformate con i mutanti BCR-ABL T315I e E255K con valori di IC50 di 2,3 μM e 1,0 μM, rispettivamente, inducendo la degradazione sia della proteina BCR-ABL wild-type che dei mutanti. [3]

La Tanespimycin (17-AAG) mostra un'affinità di legame significativamente più elevata per Hsp90 da xenotrapianti 3T3-src, B16 o CT26 in topi nudi con valori di IC50 di 8-35 nM rispetto a quella dei tessuti normali con valori di IC50 di 200-600 nM. [1] L'amministrazione di questo composto (~50 mg/kg) provoca un significativo calo dell'espressione di AR, HER2, HER3 e Akt in modo dose-dipendente con un calo >50% alla dose di 50 mg/kg, con conseguente inibizione dose-dipendente della crescita di xenotrapianti di cancro alla prostata androgeno-dipendenti (CWR22) e indipendenti (CWR22R e CWRSA6) rispettivamente del 67%, 80% e 68% alla dose di 50 mg/kg. [2]

• Saggi di legame Hsp90

  Proteina Hsp90 nativa purificata o lisati cellulari da cellule tumorali con sovraespressione di HER-2 (BT474, N87, SKOV3 e SKBR3) o cellule di carcinoma mammario BT474 in tampone di lisi (20 mM HEPES, pH 7.3, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl₂, 100 mM KCl) vengono incubati con varie concentrazioni di Tanespimycin (17-AAG) per 30 minuti a 4 °C, e poi incubati con biotina-GM legata a perline magnetiche di streptavidina BioMag per 1 ora a 4 °C. I tubi vengono posti su un supporto magnetico, e il supernatante non legato viene rimosso. Le perline magnetiche vengono lavate tre volte in tampone di lisi e riscaldate per 5 minuti a 95 °C in tampone campione SDS-PAGE. I campioni vengono analizzati su gel proteici SDS, e vengono eseguiti western blot usando gli anticorpi indicati. Le bande nei western blot vengono quantificate usando il Bio-rad Fluor-S MultiImager, e viene calcolata la percentuale di inibizione del legame di Hsp90 alla biotina-GM. L'IC50 riportata è la concentrazione di questo composto necessaria per causare un'inibizione della metà massima del legame.

• Linee cellulari

  BT474, SKBR3, N87, SKOV3, MCF7, MDA468, Hs578T, Hs578Bst, A549, HT29, U87, SKMG3, HT1080, RPTEC, NDF, HMVEC, HMEC, HUVEC, and PBMC cells

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Tempo di incubazione

  5 days

• Metodo

  Cells are seeded in 96-well plates at 2,000 cells per well in a final culture volume of 100 μL for 24 hours before the addition of increasing concentrations of Tanespimycin (17-AAG), which is incubated for 5 days. Viable cell number is determined using the Celltiter 96 AQueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay. The value of the background absorbance at 490 nm (A₄₉₀) of wells not containing cells is subtracted. Percentage of viable cells = (A₄₉₀ of this compound treated sample/A₄₉₀ untreated cells) × 100. The IC50 is defined as the concentration that gave rise to 50% viable cell number.

• Modelli animali

  Male nu/nu athymic mice inoculated s.c. with androgen-dependent CWR22 xenograft, and female nu/nu athymic mice inoculated s.c. with androgen-independent xenografts CWR22R and CWRSA6

• Dosaggi

  ~50 mg/kg

• Somministrazione

  Injection i.p.