Sunitinib (SU11248) Malate

Il Sunitinib inibisce potentemente anche Kit e FLT-3. [1] Il Sunitinib è un potente inibitore ATP-competitivo di VEGFR2 (Flk1) e PDGFRβ con K_i di 9 nM e 8 nM, rispettivamente, mostrando una selettività >10 volte superiore per VEGFR2 e PDGFR rispetto a FGFR-1, EGFR, Cdk2, Met, IGFR-1, Abl e src. Nelle cellule NIH-3T3 private di siero che esprimono VEGFR2 o PDGFRβ, il Sunitinib inibisce la fosforilazione di VEGFR2 dipendente da VEGF e la fosforilazione di PDGFRβ dipendente da PDGF con IC50 di 10 nM e 10 nM, rispettivamente. Il Sunitinib inibisce la proliferazione delle HUVEC private di siero indotta da VEGF con IC50 di 40 nM, e inibisce la proliferazione delle cellule NIH-3T3 che sovraesprimono PDGFRβ o PDGFRα indotta da PDGF con IC50 di 39 nM e 69 nM, rispettivamente. [2] Il Sunitinib inibisce la fosforilazione di FLT3 wild-type, FLT3-ITD e FLT3-Asp835 con IC50 di 250 nM, 50 nM e 30 nM, rispettivamente. Il Sunitinib inibisce la proliferazione delle cellule MV4;11 e OC1-AML5 con IC50 di 8 nM e 14 nM, rispettivamente, e induce l'apoptosi in modo dose-dipendente. [3]

Coerentemente con la sostanziale e selettiva inibizione della fosforilazione e della segnalazione di VEGFR2 o PDGFR in vivo, Sunitinib (20-80 mg/kg/giorno) mostra un'ampia e potente attività antitumorale dose-dipendente contro una varietà di modelli di xenotrapianto tumorale inclusi HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375 o MDA-MB-435. La somministrazione di Sunitinib a 80 mg/kg/giorno per 21 giorni porta a una regressione tumorale completa in sei su otto topi, senza ricrescita tumorale durante un periodo di osservazione di 110 giorni dopo la fine del trattamento. Il secondo ciclo di trattamento con Sunitinib rimane efficace contro i tumori che non sono completamente regrediti durante il primo ciclo di trattamento. Il trattamento con Sunitinib determina una significativa diminuzione della MVD tumorale, con una riduzione di circa il 40% nei tumori del glioma SF763T. Il trattamento con SU11248 determina un'inibizione completa della crescita tumorale aggiuntiva di xenotrapianti PC-3M che esprimono luciferasi, nonostante l'assenza di riduzione delle dimensioni del tumore. [2] Il trattamento con Sunitinib (20 mg/kg/giorno) sopprime drasticamente la crescita di xenotrapianti sottocutanei MV4;11 (FLT3-ITD) e prolunga la sopravvivenza nel modello di innesto di midollo osseo FLT3-ITD. [3]

• Saggi biochimici della tirosina chinasi

  I valori di IC50 per Sunitinib contro VEGFR2 (Flk-1) e PDGFRβ sono determinati utilizzando proteine di fusione della glutatione S-transferasi contenenti il dominio citoplasmatico completo del RTK. I saggi biochimici della tirosina chinasi per quantificare l'attività di transfosforilazione di VEGFR2 (Flk-1) e PDGFRβ vengono eseguiti in piastre per microtitolazione a 96 pozzetti pre-rivestite (20 μg/pozzetto in PBS; incubate una notte a 4 °C) con il substrato peptidico poli-Glu,Tyr (4:1). I siti di legame proteico in eccesso vengono bloccati con l'aggiunta di 1-5% (p/v) di BSA in PBS. Le proteine di fusione GST purificate vengono prodotte in cellule di insetto infettate da baculovirus. GST-VEGFR2 e GST-PDGFRβ vengono quindi aggiunti ai pozzetti della microtitolazione in un tampone di diluizione della chinasi a concentrazione 2 × costituito da 100 mM HEPES, 50 mM NaCl, 40 μM NaVO₄ e 0,02% (p/v) di BSA. La concentrazione finale dell'enzima per GST-VEGFR2 o GST-PDGFRβ è di 50 ng/mL. Venticinque μL di Sunitinib diluito vengono successivamente aggiunti a ciascun pozzetto di reazione per produrre un intervallo di concentrazioni di inibitore appropriate per ciascun enzima. La reazione della chinasi viene avviata con l'aggiunta di diverse concentrazioni di ATP in una soluzione di MnCl₂ in modo che le concentrazioni finali di ATP coprano il Km per l'enzima, e la concentrazione finale di MnCl₂ sia di 10 mM. Le piastre vengono incubate per 5-15 minuti a temperatura ambiente prima di arrestare la reazione con l'aggiunta di EDTA. Le piastre vengono quindi lavate tre volte con TBST. Antisieri policlonali di coniglio anti-fosfotirosina vengono aggiunti ai pozzetti a una diluizione di 1:10.000 in TBST contenente 0,5% (p/v) di BSA, 0,025% (p/v) di latte scremato in polvere e 100 μM di NaVO₄ e incubati per 1 ora a 37 °C. Le piastre vengono quindi lavate tre volte con TBST, seguite dall'aggiunta di antisieri di capra anti-coniglio coniugati con perossidasi di rafano (diluizione 1:10.000 in TBST). Le piastre vengono incubate per 1 ora a 37 °C e quindi lavate tre volte con TBST. La quantità di fosfotirosina in ciascun pozzetto viene quantificata dopo l'aggiunta di 2,2′-azino-di-[3-etilbenzotiazolina solfonato] come substrato.

• Linee cellulari

  RS4;11, MV4;11, and OC1-AML5

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~10 μM

• Tempo di incubazione

  24 and 48 hours

• Metodo

  Cells are starved overnight in medium containing 0.1% FBS prior to addition of Sunitinib and FL (50 ng/mL; FLT3-WT cells only). Proliferation is measured after 48 hours of culture using the Alamar Blue assay or trypan blue cell viability assays. Apoptosis is measured 24 hours after Sunitinib addition by Western blotting to detect cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) or levels of caspase-3.

• Modelli animali

  Female nu/nu mice implanted s.c. with HT-29, A431, Colo205, H-460, SF763T, C6, A375, or MDA-MB-435, and male nu/nu mice bearing luciferase-expressing PC-3M tumors

• Dosaggi

  ~80 mg/kg

• Somministrazione

  Orally once daily