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Descrizione biologica
| Specificità | SSEA4 Antibody [E20H6] rileva i livelli endogeni della proteina SSEA4 totale. |
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| Contesto | SSEA4 (Stage-Specific Embryonic Antigen 4) è un epitopo glicolipidico esacaridico sialilato (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc-Cer) presente sulle cellule staminali embrionali umane (hESC), sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), sulle cellule di teratocarcinoma e sulle cellule staminali tumorali, ma assente dalle cellule somatiche differenziate o dalle cellule pluripotenti di topo. La sua testa di carboidrato adotta una conformazione a ferro di cavallo riconosciuta dagli anticorpi MC813 attraverso una rete di legami idrogeno che coinvolgono il carbossilato dell'acido sialico terminale (Neu5Ac) con Asp54H/Gly53H e gli idrossili di N-acetil GalNAc con Asp49L, il che ne supporta l'utilità per la rilevazione specifica degli stati di pluripotenza tramite citometria a flusso e immunoistochimica. Il legame α-Gal rigido del glicano e i legami glicosidici β1-3 mantengono una conformazione stabile ed estesa sopra le code lipidiche di ceramide nelle membrane plasmatiche, dove SSEA4 supporta attivamente la staminalità modulando la segnalazione Wnt/β-catenina attraverso l'interazione diretta con il co-recettore LRP6, consentendo l'attivazione della via indipendente dal ligando, e reclutando PI3K/Akt attraverso il raggruppamento mediato dal glicano che sostiene il circuito Nanog/Oct4/Sox2 essenziale per l'auto-rinnovamento. Durante la differenziazione, la down-regolazione delle glicosiltransferasi (ST3GAL6, B3GALT5) rimuove progressivamente l'acido sialico terminale, convertendo SSEA4 in SSEA3 ed estinguendo la sua competenza di segnalazione. |
Informazioni sullutilizzo
| Applicazione | IF, FCM | Diluizione |
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|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Reattività | Human | ||||||
| Fonte | Mouse Monoclonal Antibody | MW | |||||
| Tampone di conservazione | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3 | Conservazione (Dalla data di ricevimento) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
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Riferimenti
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