Selisistat (EX-527)

Selisistat (EX 527) esibisce un potente effetto inibitorio contro l'attività deacetilasica di SIRT1 in modo dose-dipendente con un IC50 di 38 nM, e mostra un'attività molto inferiore contro SIRT2 e SIRT3 con valori di IC50 di 19,6 μM e 48,7 μM, rispettivamente. Non inibisce SIRT4-7 e l'attività HDAC di classe I/II a concentrazioni fino a 100 μM. Questo composto da solo (1 μM) non ha alcun effetto rilevabile sull'acetilazione della lisina 382 di p53 nelle cellule NCI-H460, ma aumenta significativamente la quantità di p53 acetilata nelle cellule NCI-H460, nelle cellule epiteliali mammarie umane, nelle cellule U-2 OS e MCF-7 sottoposte ad agenti genotossici come il perossido di idrogeno, che è più efficace di quello causato dalla nicotinamide (5 mM). Sorprendentemente, non produce effetti rilevabili sull'espressione genica controllata da p53, sulla sopravvivenza cellulare o sulla proliferazione cellulare. [1] Provoca un aumento del 90% nel numero di cellule HCT116 dopo 7 giorni in condizione di siero allo 0,1% ma non al 10% di siero, suggerendo che SIRT1 è un regolatore significativo della proliferazione cellulare durante le condizioni di privazione di fattori di crescita. [2] Inoltre, abroga gli effetti del resveratrolo sulle risposte al glucosio e previene l'up-regulation indotta dal resveratrolo di Glut2, glucocinasi, Pdx-1 e Tfam nelle cellule INS-1E, a causa dell'effetto opposto di EX 527 e resveratrolo sull'attività deacetilasica di SIRT1. [3]

La somministrazione di Selisistat (EX 527; ~10 μg) a ratti aumenta i livelli ipotalamici di acetil-p53 inibendo l'attività ipotalamica di SIRT1. La co-somministrazione di questo composto con la grelina attenua marcatamente l'azione oressigena della grelina diminuendo i livelli di pAMPK, aumentando i livelli di ACC e abolendo la maggiore espressione dei fattori di trascrizione FoxO1, pCREB e Bsx e dei neuropeptidi NPY e AgRP nel nucleo arcuato ipotalamico. [4]

• Inibizione dell'attività deacetilasica di GST-SIRT1

  Le cellule 293T vengono transitoriamente trasfettate con SIRT1 umano marcato con GST nel vettore pDEST27 Gateway usando FuGENE-6. Dopo 48 ore, le cellule vengono lisate con 50 mM Tris, pH 8,0, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0,5% Nonidet P-40, supplementato con compresse di cocktail di inibitori di proteasi Complete Mini. La GST-SIRT1 viene purificata dai lisati e lavata abbondantemente nel tampone sopra indicato. Il saggio di deacetilazione viene eseguito con circa 30 ng di GST-SIRT1 in presenza di Selisistat (EX 527) (da 48 pM a 100 μM). La deacetilazione viene misurata utilizzando il kit Fluor de Lys che utilizza un peptide fluorogenico che comprende i residui da 379 a 382 di p53, acetilato sulla lisina 382. Il residuo di lisina acetilata è accoppiato a una porzione di aminometilcumarina. Il peptide viene deacetilato da SIRT1, seguito dall'aggiunta di uno sviluppatore proteolitico che rilascia l'aminometilcumarina fluorescente. Brevemente, le preparazioni enzimatiche vengono incubate con 170 μM di NAD⁺ e 100 μM di peptide fluorogenico p53 per 45 minuti a 37 °C seguiti da incubazione nello sviluppatore per 15 minuti a 37 °C. La fluorescenza viene misurata per eccitazione a 360 nm ed emissione a 460 nm e l'attività enzimatica è espressa in unità di fluorescenza relativa.

• Linee cellulari

  NCI-H460, MCF-7, U-2 OS and HMEC

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentration 1 μM

• Tempo di incubazione

  48 or 72 hours

• Metodo

  For viability assays, cells are treated with Selisistat (EX 527) for 48 hours. Cell viability is then determined using the Cell Titer-Glo luminescent assay, which measures total ATP level as an index of cell number. Luminescence is measured on a Luminoskan Ascent. For the proliferation assay, 0.5 μCi/mL of [¹⁴C]thymidine is added to the medium immediately after this compound. Plates are counted at 48 hours (HMEC) or 72 hours (NCI-H460, MCF-7, and U-2 OS cells) in a Microbeta liquid scintillation counter. Thymidine incorporated by the cells is detected by proximity to the scintillant in the base of the Cytostar-T tissue culture plate.

• Modelli animali

  Male Sprague-Dawley rats

• Dosaggi

  ~5 μg/rat

• Somministrazione

  Intracerebroventricular injection