Seletalisib (UCB-5857)

Seletalisib (UCB-5857) è un inibitore potente, ATP-competitivo e selettivo di PI3Kδ in grado di bloccare la fosforilazione della proteina chinasi B (AKT) in seguito all'attivazione del recettore delle cellule B in una linea cellulare di cellule B. Inoltre, ha inibito il rilascio di superossido stimolato da N-formil peptide ma non stimolato da forbolo miristato acetato da neutrofili umani, coerentemente con un'attività specifica di PI3Kδ. I risultati degli studi cellulari sull'immunità adattativa hanno dimostrato che questo composto blocca la produzione di diverse citochine da parte delle cellule T umane da cellule T attivate. Inoltre, ha inibito la proliferazione delle cellule B e il rilascio di citochine. Negli studi su sangue intero umano, l'inibitore ha soppresso l'espressione di CD69 all'attivazione delle cellule B e la degranulazione dei basofili mediata da anti-IgE. Su 239 chinasi esaminate, seletalisib a una concentrazione di 10 μM non ha mostrato un'attività inibitoria superiore al 47% (MAP4K4) contro enzimi chinasi non-PI3K. Contro enzimi non-chinasi, ha mostrato deboli attività contro la fosfodiesterasi (PDE)3A, PDE2A1 e PDE4D2, con un'inibizione variabile tra il 32 e il 74% a 10 μM. Quando esaminato a una concentrazione di 10 μM contro 55 recettori e canali ionici, la massima attività inibitoria osservata è stata del 20%. Un recettore, il recettore del neuropeptide Y (Y1), ha mostrato un'attivazione del 54%. Studi di legame ai recettori in vitro e saggi enzimatici su una vasta gamma di classi di bersagli hanno mostrato che è selettivo per PI3Kδ. Il composto ha potentemente inibito la fosforilazione di AKT in seguito alla stimolazione con anti-IgM del BCR sulle cellule Ramos con una IC50 di 15 nM[1]. Quando profilato in un'ampia gamma di sistemi di saggio su cellule primarie, inclusi fibroblasti, cellule epiteliali, endoteliali e muscolari lisce vascolari, ha mostrato un'attività significativa solo in quei sistemi contenenti linfociti, dimostrando la sua selettività funzionale verso le cellule che esprimono PI3Kδ[2].

Seletalisib (UCB-5857) mostra un'inibizione dose-dipendente in un modello murino in vivo di rilascio di interleuchina 2 indotto da anticorpo anti-CD3. L'analisi della relazione tra l'inibizione del rilascio di IL-2 e la sua concentrazione ematica, utilizzando dati combinati tra gli esperimenti, ha dimostrato che questo composto ha potenti effetti in vivo con un valore di IC50 stimato di <10 nM[1]. Negli studi di primo utilizzo nell'uomo, i profili medi di concentrazione plasmatica-tempo sono aumentati con l'aumentare della dose dopo somministrazione singola e multipla, senza deviazioni importanti dalla proporzionalità della dose. Non c'è stata accumulazione inattesa o perdita di esposizione dopo somministrazioni multiple (profilo farmacocinetico (PK) indipendente dal tempo) e i valori apparenti di t1/2 (circa 20h) hanno supportato una somministrazione una volta al giorno[2].

• Saggi di attività chinasica in vitro e profilazione off-target

  Le attività di seletalisib (UCB-5857) e dell'inibitore pan-PI3K UCB1370037 sono state testate in saggi chinasici biochimici delle isoforme PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ e PI3Kγ (prodotte internamente). Sono stati eseguiti saggi competitivi di trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) risolta nel tempo (TR) utilizzando un kit di reagenti per saggi PI3K in quattro passaggi. In questo saggio, l'attività di PI3K viene misurata mediante la rilevazione del fosfatidilinositolo trifosfato (PIP3) come segue: Si forma un complesso tra PIP3 biotinilato e una proteina con dominio di omologia di pleckstrina (GST), che vengono rilevati rispettivamente da streptavidina-alloficocianina (APC) e anticorpo anti-GST marcato con europio. La prossimità dei due fluorofori si traduce in un segnale TR-FRET stabile. La produzione di PIP3 non marcato da parte di PI3K nella reazione chinasica si traduce in un'inibizione competitiva del complesso e quindi del segnale FRET. Brevemente, 2 μl di composto sono stati aggiunti ai pozzetti contenenti 8 μl di una miscela contenente il substrato fosfatidilinositolo bifosfato (PIP2) e ATP, prima dell'aggiunta di 10 μl di PI3K (prediluita alla concentrazione richiesta). Le concentrazioni finali di ATP e substrato PIP2 nel saggio erano rispettivamente di 2 μM e 10 μM. La concentrazione finale degli enzimi PI3K nel saggio era di 1–8 nM a seconda dell'attività del lotto. La concentrazione finale di DMSO nel saggio era del 2,0%. La piastra è stata incubata a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'aggiunta del tampone di arresto e del tampone di rilevamento secondo le istruzioni del produttore, e la piastra è stata quindi incubata per altre 6 ore a temperatura ambiente. Le misurazioni TR-FRET sono state eseguite su un lettore di piastre Analyst GT. La dipendenza dalla concentrazione di ATP dell'attività di questo composto contro PI3Kδ è stata stabilita eseguendo il saggio in presenza di concentrazioni variabili di ATP (2, 40, 200 e 1000 μM). Le concentrazioni finali di PI3Kδ e substrato PIP2 in questi saggi erano rispettivamente di 1 nM e 25 μM.

• Linee cellulari

  Ramos B-cell line

• Concentrazioni

  0.1 nM-10 μM

• Tempo di incubazione

  10 min

• Metodo

  Serially diluted seletalisib (UCB-5857) and goat anti-human F(ab)2 IgM in serum-free RPMI 1640 were added to Ramos cells plated in serum-free RPMI 1640. The plate was incubated for 10 minutes, chilled on ice, and the cells pelleted by centrifugation. Cellular phosphorylated AKT was detected by MSD assay.

• Modelli animali

  Adult Lewis rats (male, 6-8 weeks of age)

• Dosaggi

  0.1-10 mg/kg in 500 μl volume

• Somministrazione

  via oral gavage