MK-8776 (SCH 900776)

MK-8776 (SCH 900776) è un inibitore meno potente di Chk2 e CDK2 con IC50 di 1,5 μM e 0,16 μM, rispettivamente. Non mostra alcuna inibizione significativa delle isoforme microsomiali epatiche umane del citocromo P450 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 e 3A4. In combinazione con un antimetabolita, questo composto induce l'accumulo di γ-H2AX entro 2 ore, indicativo di un collasso della forcella di replicazione e di rotture del DNA a doppio filamento. Inoltre, sopprime l'accumulo dell'autofosforilazione di Chk1 pS296 in modo dose-dipendente. L'esposizione delle cellule WS1 proliferanti a SCH 900776 è associata a un rapido accumulo dose-dipendente di Chk1 pS345, indicando che le popolazioni di cellule normali in ciclo inducono Chk1 pS345 dopo l'esposizione ad esso come parte di un ciclo futile, forse guidato dalle chinasi della famiglia AT e dalla DNA-PK.[1]

L'escalation della dose di MK-8776 (SCH 900776) (16 mg/kg e 32 mg/kg) induce miglioramenti incrementali nella risposta tumorale. È importante sottolineare che le dosi di questo composto associate a una robusta attivazione dei biomarcatori e a una migliore risposta tumorale non sono associate a una maggiore tossicità sui parametri ematologici nei topi BALB/c. [1]

• Saggio Chk1 SPA

  Un saggio in vitro che utilizza His-Chk1 ricombinante espressa nel sistema di espressione del baculovirus come fonte enzimatica e peptide biotinilato basato su CDC25C come substrato. His-Chk1 viene diluito a 32 nM in tampone chinasi contenente 50 mM Tris pH 8,0, 10 mM MgCl₂ e 1 mM DTT. Il peptide CDC25C (peptide biotinilato CDC25 Ser216 C-terminale) viene diluito a 1,93 μM in tampone chinasi. Per ogni reazione chinasi, 20 μL di soluzione enzimatica Chk1 a 32 nM e 20 μL di CDC25C a 1,926 μM vengono miscelati e combinati con 10 μL di MK-8776 (SCH 900776) diluito in 10% DMSO, ottenendo concentrazioni finali di reazione di 6,2 nM Chk1, 385 nM CDC25C e 1% DMSO dopo l'aggiunta della soluzione di avvio. La reazione viene avviata mediante l'aggiunta di 50 μL di soluzione di avvio composta da 2 μM ATP e 0,2 μCi di ³³P-ATP, ottenendo una concentrazione finale di reazione di 1 μM ATP, con 0,2 μCi di ³³P-ATP per reazione. Le reazioni chinasi vengono eseguite per 2 ore a temperatura ambiente e vengono arrestate mediante l'aggiunta di 100 μL di soluzione di arresto composta da 2 M NaCl, 1% H₃PO₄ e 5 mg/mL di perline SPA rivestite di streptavidina. Le perline SPA vengono catturate utilizzando una piastra filtrante GF/B a 96 pozzetti e un raccoglitore universale Filtermate. Le perline vengono lavate due volte con 2 M NaCl e due volte con 2 M NaCl con 1% di acido fosforico. Il segnale viene quindi analizzato utilizzando un contatore a scintillazione liquida TopCount a 96 pozzetti. Le curve dose-risposta vengono generate da diluizioni seriali doppie a 8 punti di questo composto. I valori di IC50 vengono derivati mediante analisi di regressione non lineare.

• Linee cellulari

  mESCs

• Concentrazioni

  10 μM

• Tempo di incubazione

  1 h

• Metodo

  Cells were treated with MK-8776 (SCH 900776), other inhibitors, or vehicle for 1 hour.

• Modelli animali

  Female nude mice injected subcutaneously with A2780 or MiaPaCa2 cells

• Dosaggi

  ~50 mg/kg

• Somministrazione

  Administered intraperitoneally