Salirasib

Le membrane sinaptosomiali del cervelletto di ratto o le membrane totali di linee cellulari coltivate (pellet di 100.000 × g) vengono utilizzate per i saggi di metiltransferasi in sistemi acellulari. I saggi di metiltransferasi vengono eseguiti a 37 °C in tampone Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, utilizzando 100 μg di proteine, 25 μM di [metil-³H]AdoMet (300.000 cpm/nmol) e 50 μM di AFC (preparata come soluzione madre in DMSO) in un volume totale di 50 μL. La concentrazione di DMSO in tutti i saggi è dell'8%. Varie concentrazioni di questo composto vengono utilizzate in diversi esperimenti come indicato nel testo. Le reazioni vengono terminate dopo 10 minuti mediante aggiunta di 500 μL di cloroformio:metanolo (1:1) con successiva aggiunta di 250 μL di H₂O, miscelazione e separazione di fase. Una porzione di 125 μL della fase cloroformica viene essiccata a 40 °C, e vengono aggiunti 200 μL di soluzione 1 N NaOH, 1% SDS. Il metanolo così formato viene contato con il metodo dell'equilibrio della fase vapore. I conteggi di fondo tipici (senza aggiunta di AFC) sono 50-100 cpm, mentre le reazioni tipiche con questa sostanza chimica producono 500-6.000 cpm. I saggi vengono eseguiti in triplicato, e i conteggi di fondo vengono sottratti. Vengono eseguite la metilazione dei substrati endogeni e l'elettroforesi su gel. La metilazione del carbossile delle proteine in cellule intatte viene determinata utilizzando 100 μCi/mL di [metil-³H]metionina. Le cellule vengono saggiate in colture quasi confluenti cresciute in piastre da 10 cm con 5 mL di mezzo di marcatura.

PC12, CHE, T-antigen-transformed CHE, endothelial cells, astrocytes, B16, Rat1, EJ, NIH3T3, v-Raf-transformed NIH3T3 cell lines

~100 μM

10 days

Cells are grown in 24-well plates. 2 h after plating, the cells receive either solvent or this compound freshly prepared from a stock solution to yield the final indicated concentrations in 0.1% DMSO. Media are replaced every 4 days with fresh medium containing the solvent or the drug. Separate experiments indicate that the solvent itself has no effect on cell growth. On the indicated days, the cells are detached from plates by trypsin/EDTA and counted under the light microscope. All assays are performed in quadruplicate. In parallel experiments, cells are stained either with trypan blue or with MTT, and the stained cells are examined under the light microscope. In some MTT-stained cultures, the cells are dissolved in 0.2 mL of 100% DMSO, and the extent of staining is determined spectrophotometrically using an enzyme-linked immunosorbent assay reader.

Panc-1 xenografted nude mice

5 mg/kg daily

i.p.