Ro-3306

RO-3306 inibisce l'attività di CDK1/ciclina B1, CDK1/ciclina A, CDK2/ciclina E e CDK4/ciclina D con Ki di 35 nM, 110 nM, 340 nM e oltre 2000 nM, rispettivamente. Il trattamento delle cellule HCT116, SW480 e HeLa con RO-3306 per 20 h porta a un blocco completo del ciclo cellulare nella fase G2/M. La proliferazione di HCT116 e SW480 è efficacemente bloccata da RO-3306. RO-3306 sembra essere più proapoptotico nelle cellule tumorali (HCT116 e SW480) rispetto alle cellule non tumorigeniche (MCF 10A e MCF 12A).[1]

RO-3306 arresta efficacemente la maturazione degli ovociti a una concentrazione di 10 μM.[2]

RO-3306 è un inibitore CDK1 ATP-competitivo e selettivo.

• Saggio CDK

  L'attività di CDK1 ciclina B1, CDK1 ciclina A, CDK2 ciclina E e CDK4 ciclina D viene misurata mediante un saggio di fluorescenza risolta nel tempo omogeneo in un formato a 96 pozzetti. Il tampone di saggio conteneva 25 mM Hepes, 6,25 mM MgCl2, 0,003% Tween 20, 0,3 mg/mL BSA, 1,5 mM DTT e ATP come segue: 162 μM (CDK1), 90 mM (CDK2) o 135 μM (CDK4). Il tampone CDK1 e CDK2 conteneva 10 mM MgCl2. I composti di prova vengono diluiti nel tampone di saggio a 3 volte la loro concentrazione finale in 20 μL, e la reazione viene avviata con l'aggiunta di 40 μL di tampone di saggio contenente il substrato pRB (0,185 μM). Le piastre vengono incubate a 37°C per 30 min con agitazione costante, e la reazione viene terminata con l'aggiunta di 15 μL di anticorpo anti-pRB fosforilato (Ser-780) 1,6 μM in 25 mM Hepes, 24 mM EDTA e 0,2 mg/mL BSA. Dopo un'ulteriore incubazione di 30 min con agitazione, vengono aggiunti 15 μL di IgG anti-coniglio marcata con Lance-Eu-W1024 3 nM e 60 nM di anticorpo anti-His-6 coniugato con alloficocianina in 25 mM Hepes e 0,5 mg/mL BSA e incubati per 1 ora. Le piastre vengono lette nel lettore multi-etichette Victor-V con eccitazione a 340 nm ed emissione a 615 nm e 665 nm. I valori IC50 vengono calcolati dalle letture a 665 nm e normalizzati per le letture dell'Europio a 615 nm. I valori Ki vengono calcolati secondo l'equazione: Ki= IC50/(1 + S/Km ), dove S è la concentrazione di ATP nel saggio e Km è la costante di Michaelis-Menten per l'ATP. L'attività inibitoria contro il pannello di chinasi è determinata dalla tecnologia di saggio IMAP.

• Linee cellulari

  MDA-MB-231 cell line

• Concentrazioni

  20 μM

• Tempo di incubazione

  72 h

• Metodo

  Log phases cells (25,000) are seeed in 96-well plates and incubated in a 37℃ incubator with CO2, After 24 h, different concentrations of RO-3306 are administered to determine the drug concentrations required to achieve a 50% growth inhibition (IC50). MTT (20 μL, 5mg/mL stock solution in saline) is added to each well and the cells are incubated for 4 h. Supernatants are removed and formazan crystals from viable cells are solubilized with 200 μL anhydrous DMSO. The absorbance is detected with a 550 model microplate reader at the 565 nm wavelength.

• Modelli animali

  Female BALB/c mice

• Dosaggi

  1.5 mg/kg

• Somministrazione

  i.n.