Rapamycin (Sirolimus)

La Rapamycin inibisce l'attività endogena di mTOR nelle cellule HEK293 con IC50 di ~0.1 nM, più potentemente di iRap e AP21967 con IC50 di ~5 nM e ~10 nM, rispettivamente. [1] In Saccharomyces cerevisiae, il trattamento con questo composto induce un grave arresto del ciclo cellulare G1/S e l'inibizione dell'inizio della traduzione a livelli inferiori al 20% del controllo. [2] Inibisce significativamente la vitalità cellulare di T98G e U87-MG in modo dose-dipendente con IC50 di 2 nM e 1 μM, rispettivamente, mostrando poca attività contro le cellule U373-MG con IC50 di >25 μM nonostante la simile estensione dell'inibizione della segnalazione di mTOR. Questa sostanza chimica (100 nM) induce l'arresto in G1 e l'Autophagy ma non l'apoptosi nelle cellule U87-MG e T98G sensibili alla Rapamycin inibendo la funzione di mTOR. [3]

Il trattamento con Rapamycin in vivo blocca specificamente i bersagli noti per essere a valle di mTOR, come la fosforilazione e l'attivazione della p70S6K e il rilascio dell'inibizione di eIF4E da parte di PHAS-1/4E-BP1, portando al blocco completo degli aumenti ipertrofici del peso del muscolo plantare e della dimensione delle fibre. [4] Il trattamento a breve termine con questo composto, anche alla dose più bassa di 0.16 mg/kg, produce una profonda inibizione dell'attività della p70S6K, che è correlata a un aumento della morte delle cellule tumorali e della necrosi dei tumori renali di Eker. [5] Questo agente chimico inibisce la crescita tumorale metastatica e l'angiogenesi nei modelli di xenotrapianto CT-26 riducendo la produzione di VEGF e bloccando la segnalazione delle cellule endoteliali indotta da VEGF. [6] Il trattamento con questo composto a 4 mg/kg/die riduce significativamente la crescita tumorale degli xenotrapianti C6 e la permeabilità vascolare tumorale. [7]

• Immunoblotting per il saggio della chinasi mTOR

  Le cellule HEK293 vengono piastrate a 2-2.5×10⁵ cellule/pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e private di siero per 24 ore in DMEM. Le cellule vengono trattate con concentrazioni crescenti di Rapamycin (0.05-50 nM) per 15 minuti a 37 °C. Il siero viene aggiunto a una concentrazione finale del 20% per 30 minuti a 37 °C. Le cellule vengono lisate e i lisati cellulari vengono separati mediante SDS-PAGE. Le proteine risolte vengono trasferite su una membrana di difluoruro di polivinilidene e immunobloccate con un anticorpo primario fosfo-specifico contro Thr-389 della p70 S6 chinasi. I dati vengono analizzati utilizzando ImageQuant e KaleidaGr

• Linee cellulari

  U87-MG, T98G, and U373-MG

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~25 μM

• Tempo di incubazione

  72 hours

• Metodo

  Cells are exposed to various concentrations of Rapamycin for 72 hours. For the assessment of cell viability, cells are collected by trypsinization, stained with trypan blue, and the viable cells in each well are counted. For the determination of cell cycle, cells are trypsinized, fixed with 70% ethanol, and stained with propidium iodide using a flow cytometry reagent set. Samples are analyzed for DNA content using a FACScan flow cytometer and CellQuest software. For apoptosis detection, cells are stained with the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) technique using an ApopTag apoptosis detection kit. To detect the development of acidic vesicular organelles (AVO), cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, and examined under a fluorescence microscope. To quantify the development of AVOs, cells are stained with acridine orange (1 μg/mL) for 15 minutes, removed from the plate with trypsin-EDTA, and analyzed using the FACScan flow cytometer and CellQuest software. To analyze the autophagic process, cells are incubated for 10 minutes with 0.05 mM monodansylcadaverine at 37 °C and are then observed under a fluorescence microscope.

• Modelli animali

  Athymic Nu/Nu mice inoculated subcutaneously with VEGF-A-expressing C6 rat glioma cells

• Dosaggi

  ~4 mg/kg/day

• Somministrazione

  Injection i.p.