PR-619

PR-619 è un inibitore DUB a largo spettro, permeabile alle cellule, della classe delle piridinammine, i cui bersagli noti includono ATXN3, BAP1, JOSD2, OTUD5, UCH-L1, UCH-L3, UCH-L5/UCH37, USP1, 2, 4, 5, 7, 8, 9X, 10, 14, 15, 16, 19, 20, 22, 24, 28, 47, 48, VCIP135, YOD1, nonché la deISGylase PLpro, la deNEDDylase DEN1 e la deSUMOlyase SENP6. Questo composto ha dimostrato di aumentare la poliubiquitinazione proteica complessiva nelle cellule HEK293T in modo dose- e tempo-dipendente (20 a 150 μM, da 0,5 a 20 h). Il trattamento con questa sostanza chimica comporta una sovraregolazione di entrambe le catene poliUb legate a K⁴⁸ e K⁶³. Induce la morte cellulare HCT116 con valori di EC50 di 6,3 μM.[1]

PR-619 aumenta l'effetto antitumorale sul xenotrapianto di UC di topi nudi.

• Saggio Ub-PLA₂

  Gli enzimi ricombinanti in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM CaCl₂ e 2 mM β-mercaptoetanolo (DUB assay buffer) vengono preincubati con singole dosi o intervalli di dosi di PR-619 o P22077 per 30 minuti in una piastra a 96 pozzetti prima dell'aggiunta di Ub-PLA₂ e NBD C6-HPC. La liberazione di un prodotto fluorescente entro l'intervallo lineare del saggio viene monitorata a temperatura ambiente utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Il veicolo (2%(v/v) DMSO) e 10 mM di N-etilmaleimide sono inclusi come controlli. Se si osserva un'inibizione ≥60%, i valori di EC50 vengono determinati utilizzando un'equazione di risposta dose-effetto sigmoide.

• Linee cellulari

  HCT116, HEK293T

• Concentrazioni

  0.5-50 μM

• Tempo di incubazione

  72 h

• Metodo

  72 h hours later, 0.2 mg/mL resazurin prepared in phosphate-buffered saline is added to each well and the cells are incubated for an additional 3-6 h. The fluorescence of the resazurin reduction product is measured using Ex=535 nm and Em=590 nm filters on a fluorimeter. The EC50 values are calculated in Prism.