PP2 (AGL 1879)

PP2 inibisce Src legandosi a un'area della molecola che non si sovrappone al dominio di legame dell'ATP. [2] Questo composto (20 μM) induce un'inibizione della crescita del 40-50% delle cellule HT29, questa concentrazione riduce l'attività di Src già dopo 1 ora e mantiene un'inibizione del 35% dell'attività di Src per 2 giorni. Esso (100 mM) diminuisce l'attività di Src delle cellule HT29 in modo dose-dipendente. Questa sostanza chimica (1 mM-100 mM) provoca un'inibizione della crescita dose-dipendente di cellule di cancro del colon umano (HT29, SW480 e PMCO1), cellule di cancro del fegato (PLC/PRF/5, KYN-2, Li7 e HepG2) e cellule di cancro al seno (MCF-7, MDA-MB-468 e BT-474). Esso (20 μM) aumenta significativamente l'aggregazione nella maggior parte delle cellule tumorali (HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, MCF-7 e MDA-MB-468) in modo dipendente dalla E-caderina. Questo composto (20 μM) migliora l'espressione della E-caderina e aumenta anche fortemente l'associazione della E-caderina con il citoscheletro di actina nelle cellule tumorali. Esso (20 μM) aumenta l'espressione di α-catenina, β-catenina e γ-catenina nelle cellule HT29, mentre nelle cellule PLC/PRF/5 e MCF-7, il livello proteico totale di α-catenina non cambia, ma i livelli di β-catenina e γ-catenina aumentano leggermente. [3] Questo inibitore inibisce la proliferazione di due cellule di cancro cervicale (HeLa e SiHa) in modo tempo- e dose-dipendente. Esso (10 μM) regola negativamente i livelli di espressione di pSrc-Y416, pEGFR-Y845 e -Y1173 nelle cellule HeLa e SiHa. Questa sostanza chimica (10 μM) potrebbe modulare l'arresto del ciclo cellulare regolando positivamente p21(Cip1) e p27(Kip1) in entrambe le cellule HeLa e SiHa e regolando negativamente l'espressione di ciclina A e chinasi ciclina-dipendente-2, -4 (Cdk-2, -4) nelle cellule HeLa e di ciclina B e Cdk-2 nelle cellule SiHa. [4]

PP2 (5 mg/kg/giorno) induce un certo rallentamento nel tasso di crescita dei tumori primari rispetto al controllo trattato con veicolo in topi SCID inoculati con cellule HT29 nella milza. Questo composto induce un certo rallentamento nel tasso di crescita dei tumori primari rispetto al controllo trattato con veicolo in topi SCID inoculati con cellule HT29 nella milza. Questa sostanza chimica riduce significativamente il peso relativo del fegato e il volume delle metastasi epatiche rispetto ai controlli in topi SCID inoculati con cellule HT29 nella milza. [3] Ratti trattati con questo composto (1,5 mg/kg i.p.) mostrano una riduzione approssimativa del 50% della dimensione dell'infarto alla risonanza magnetica T2-pesata e nella colorazione TTC rispetto ai controlli in ratti con lesione cerebrale ischemica focale. Questa sostanza chimica porta a un punteggio neurologico migliore rispetto ai controlli in ratti con lesione cerebrale ischemica focale. [5]

• Saggi enzimatici a complesso immune

  L'enolasi trattata con acido viene diluita 1:20 con 1× PBS prima di essere aliquotata a 100 μL/pozzetto in una piastra di saggio Nunc a 96 pozzetti ad alto legame proteico. I pozzetti del saggio vengono quindi aspirati; bloccati con 0,5% di siero bovino, 1× PBS per 1 ora a 37 ℃; e quindi lavati cinque volte con 300 μL di 1× PBS/pozzetto. La fonte di Lck è costituita da cellule LSTRA o da Lck espressa in cellule HeLa utilizzando un sistema di espressione del vaccino. FynT è espressa in cellule HeLa utilizzando il sistema del vaccino. Le cellule (12,5×10⁶/mL) vengono lisate in tampone di lisi, e i lisati vengono chiarificati per centrifugazione a 14.000 cpm per 15 minuti a 4 ℃ in una provetta Eppendorf. I lisati chiarificati vengono quindi incubati con l'anticorpo anti-chinasi appropriato a 10 μg/mL per 2 ore a 4 ℃. Perle di Proteina A-Sepharose vengono aggiunte alla miscela anticorpo/lisato a 250 μL/mL e lasciate incubare per 30 minuti a 4 ℃. Le perle vengono quindi lavate due volte in 1 mL di tampone di lisi e due volte in 1 mL di tampone chinasi (25 mM HEPES, 3 mM MnCl₂, 5 mM MgCl₂ e 100 μM ortovanadato di sodio) e risospese al 50% (p/v) in tampone chinasi. Venticinque microlitri della sospensione di perle vengono aggiunti a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti ad alto legame proteico rivestita di enolasi insieme a una concentrazione appropriata di questo composto e [γ-³²P]ATP (25 μL/pozzetto di una soluzione di 200 μCi/mL in tampone chinasi). Dopo incubazione per 20 minuti a 20 ℃, 60 μL di tampone di solubilizzazione 2× bollente contenente 10 mM ATP vengono aggiunti ai pozzetti del saggio per terminare le reazioni. Trenta microlitri dei campioni vengono rimossi dai pozzetti, bolliti per 5 minuti e caricati su un gel di SDS-poliacrilammide al 7,5%. I gel vengono successivamente essiccati ed esposti a pellicola Kodak X-AR. Per la quantificazione, i film vengono scansionati utilizzando uno scanner laser Molecular Dynamics, e viene determinata la densità ottica della banda principale del substrato, enolasi p46. In esperimenti complementari per misurare l'attività di questa sostanza chimica contro Lck, la piastra di saggio viene lavata con due cicli di lavaggio su un raccoglitore Skatron utilizzando 50 mM EDTA, 1 mM ATP. Il fluido di scintillazione (100 μL) viene quindi aggiunto ai pozzetti, e l'incorporazione di ³²P viene misurata utilizzando un micro-β-contatore.

• Linee cellulari

  HT29, SW480, PMCO1, PLC/PRF/5, KYN-2, Li7, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468 and BT-474 cell lines

• Concentrazioni

  ~100 μM

• Tempo di incubazione

  2 days

• Metodo

  Cell viability is determined using an in vitro toxicology assay kit following the manufacturer’s instructions. Cells are seeded in 96-well plates at day 0. Starting at day 1, cells are treated for 2 days with each of a series of increasing concentrations of PP2 (1 μM, 10 μM, and 100 μM). At the end of this period, cell proliferation is evaluated  by mitochondria dehydrogenase in viable cells, leading to formazan formation. This experiment is repeated three times with 10 determinations/tested concentration.

• Modelli animali

  SCID mice inoculated HT29 cells in the spleen

• Dosaggi

  5 mg/kg/day

• Somministrazione

  intraperitoneal injection