|
Come citare 1. Per la citazione nel testo (Materiali e Metodi): 2. Per la tabella delle risorse chiave: |
||
|
Numero verde: (877) 796-6397 -- Solo USA e Canada -- |
Fax: +1-832-582-8590 Ordini: +1-832-582-8158 |
Supporto tecnico: +1-832-582-8158 Ext:3 Si prega di fornire il numero dordine nelle-mail. Ci sforziamo di rispondere a tutte le richieste via e-mail entro un giorno lavorativo. |
Descrizione biologica
| Specificità | Poly/Mono-ADP Ribose Antibody [A22J18] riconosce i livelli endogeni di proteine ADP-ribosilate e non presenta reattività crociata con altre modificazioni post-traduzionali. |
|---|---|
| Contesto | La poli(ADP-ribosio) (PAR) e la mono(ADP-ribosio) (MAR) sono modificazioni post-traduzionali reversibili mediate dalle ADP-ribosiltransferasi, in particolare dai membri della famiglia delle poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP). MAR si riferisce all'aggiunta covalente di una singola unità di ADP-ribosio — trasferita da NAD⁺ — a specifici residui di amminoacidi (comunemente aspartato, glutammato o lisina) sulle proteine bersaglio. Al contrario, PAR è costituito da due o più unità di ADP-ribosio legate tramite legami glicosidici ribosio-ribosio, formando catene lineari o ramificate. Strutturalmente, ogni unità di ADP-ribosio contribuisce per circa 0,5 kDa, rendendo PAR un polimero grande, altamente carico negativamente e flessibile, capace di fungere da impalcatura per diversi assemblaggi proteici. PARP1, la PARP nucleare più abbondante e cataliticamente attiva, viene rapidamente attivata dalle rotture del filamento di DNA e dai segnali di stress, catalizzando la PARilazione per reclutare e organizzare i complessi di DNA Damage/DNA Repair. MARilazione e PARilazione svolgono ruoli cellulari distinti: MAR spesso regola l'attività o le interazioni delle singole proteine, mentre PAR svolge funzioni più ampie come elemento strutturale dinamico in processi quali DNA Damage/DNA Repair, rimodellamento della cromatina, formazione di granuli di stress, assemblaggio del fuso mitotico e integrità nucleolare. L'equilibrio tra la sintesi da parte delle PARP e la degradazione da parte di enzimi come la poli(ADP-ribosio) glico-idrolasi (PARG) e le idrolasi a macrodomini è fondamentale per mantenere l'omeostasi cellulare. |
Informazioni sullutilizzo
| Applicazione | WB, IF | Diluizione |
|
||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Reattività | All | ||||||
| Fonte | Rabbit Monoclonal Antibody | MW | |||||
| Tampone di conservazione | PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃ | Conservazione (Dalla data di ricevimento) |
-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years | ||||
| IF |
Experimental Protocol：
Specimen Preparation
1. Aspirate liquid, then cover cells to a depth of 2–3 mm with 4% Paraformaldehyde diluted in 1X PBS.
NOTE: Paraformaldehyde is toxic, use only in a fume hood.
2. Fix cells for 15 min at room temperature.
3. Aspirate fixative, rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
4. Proceed with Immunostaining.
Immunostaining
1. Add theblocking buffer and incubate for 60 min at RT.
2. Prepare primary antibody diluent in antibody dilution buffer as recommended .
3. Aspirate blocking solution, apply diluted primary antibody.
4. Incubate overnight at 4°C.
5. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
6. Incubate specimens in fluorochrome-conjugated secondary antibody diluted in antibody dilution buffer for 1–2 hr at room temperature in the dark.
7. Rinse three times in 1X PBS for 5 min each.
8. Mount slides usingmounting medium with DAPI and cover with coverslips.
9. For best results, allow mountant to cure overnight at room temperature. For long-term storage, store slides flat at 59°C protected from light.
|
| IF |
Experimental Protocol:
Sample Preparation
1. Adherent Cells: Place a clean, sterile coverslip in a culture dish. Once the cells grow to near confluence as a monolayer, remove the coverslip for further use.
2. Suspension Cells: Seed the cells onto a clean, sterile slide coated with poly-L-lysine.
3. Frozen Sections: Allow the slide to thaw at room temperature. Wash it with pure water or PBS for 2 times, 3 minutes each time.
4. Paraffin Sections: Deparaffinization and rehydration. Wash the slide with pure water or PBS for 3 times, 3 minutes each time. Then perform antigen retrieval.
Fixation
1. Fix the cell coverslips/spots or tissue sections at room temperature using a fixative such as 4% paraformaldehyde (4% PFA) for 10-15 minutes.
2. Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Permeabilization
1.Add a detergent such as 0.1–0.3% Triton X-100 to the sample and incubate at room temperature for 10–20 minutes.
(Note: This step is only required for intracellular antigens. For antigens expressed on the cell membrane, this step is unnecessary.)
Wash the sample with PBS for 3 times, 3 minutes each time.
Blocking
Add blocking solution and incubate at room temperature for at least 1 hour. (Common blocking solutions include: serum from the same source as the secondary antibody, BSA, or goat serum.)
Note: Ensure the sample remains moist during and after the blocking step to prevent drying, which can lead to high background.
Immunofluorescence Staining (Day 1)
1. Remove the blocking solution and add the diluted primary antibody.
2. Incubate the sample in a humidified chamber at 4°C overnight.
Immunofluorescence Staining (Day 2)
1. Remove the primary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
2. Add the diluted fluorescent secondary antibody and incubate in the dark at 4°C for 1–2 hours.
3. Remove the secondary antibody and wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
4. Add diluted DAPI and incubate at room temperature in the dark for 5–10 minutes.
5. Wash with PBST for 3 times, 5 minutes each time.
Mounting
1. Mount the sample with an anti-fade mounting medium.
2. Allow the slide to dry at room temperature overnight in the dark.
3. Store the slide in a slide storage box at 4°C, protected from light.
|
Riferimenti
|