Picropodophyllin (AXL1717)

Nelle cellule intatte, il PPP inibisce efficacemente la fosforilazione di IGF-1R, Akt (Ser 473) ed Erk1/2 stimolata dall'IGF-1. Inibisce specificamente la crescita cellulare e induce Apoptosis related nelle cellule tumorali IGF-1R-positive coltivate. [1] Questo composto sensibilizza sinergicamente le cellule HMCL, MM umane primarie e 5T33MM murine a ABT-737 e ABT-199 diminuendo ulteriormente la vitalità cellulare e migliorando l'Apoptosis related. [3] Sopprime inoltre sinergicamente la proliferazione e la motilità delle cellule di carcinoma epatocellulare. [4]

In topi SCID xenotrapiantati con cellule umane ES-1, BE e PC3, Picropodophyllin (PPP) (20 mg/kg/12 h, i.p.) provoca una regressione tumorale completa. [1] Questo composto mostra anche una marcata attività antitumorale e causa un aumento significativo della sopravvivenza nel modello murino 5T33MM. [2]

• Saggi della tirosina chinasi in vitro.

  Viene eseguito il saggio di fosforilazione del substrato pTG catalizzata da IGF-1R, utilizzando un kit di saggio della tirosina chinasi su piastra a 96 pozzetti. Utilizziamo il recettore ricombinante del fattore di crescita epidermico, IR immunoprecipitato da HEPG2, IGF-1R immunoprecipitato da cellule P6 e il surnatante immunodepleto di IGF-1R da P6 (rappresentante le “tirosin chinasi non-IGF-1R”). Dopo 30 minuti di trattamento dei recettori con i composti desiderati nel tampone chinasi [tampone HEPES 50 mM (pH 7.4), 20 mM MgCl₂, 0.1 MnCl₂ e 0.2 Na₃VO₄], la reazione della chinasi viene attivata con l'aggiunta di ATP. Il substrato polimerico fosforilato viene sondato con un anticorpo monoclonale specifico per la fosfotirosina coniugato alla perossidasi di rafano, clone PT-66. Il colore viene sviluppato con il substrato cromogenico della perossidasi di rafano O-fenilendiammina dicloridrato e quantificato mediante spettrofotometria (lettore ELISA). L'autofosforilazione della tirosina IGF-1R viene analizzata mediante un saggio ELISA a sandwich. In breve, le piastre a 96 pozzetti vengono rivestite durante la notte a 4°C con 1 μg/pozzetto di un anticorpo per la subunità β di IGF-1R. Le piastre vengono bloccate con 1% di BSA in PBS Tween per 1 h, quindi vengono aggiunti 80 μg/pozzetto di lisato proteico totale dalla linea cellulare P6. Come controllo negativo, utilizziamo il lisato proteico totale dalla linea cellulare R-. I composti indagati vengono aggiunti in tampone tirosin chinasi senza ATP a temperatura ambiente per 30 min prima dell'attivazione della chinasi con ATP. Il saggio chinasi viene eseguito utilizzando il kit Sigma (vedi sopra). Dopo spettrofotometria, i valori di IC50 degli inibitori vengono determinati utilizzando la funzione REGRESSION del programma Statistica.

• Linee cellulari

  Melanoma cells (FM 55, SK-MEL-28, SK-MEL-5, C8161, DFB, DFW and AA), sarcoma cells (RD-ES), breast carcinoma cells (MCF 7), prostate carcinoma cells (PC3), hepatoma cells (HepG2) and embryonic mouse fibroblasts (P6 and R-)

• Concentrazioni

  ~15 μM

• Tempo di incubazione

  48 hours

• Metodo

  All of the standards and experiments for Picropodophyllin (PPP) are performed in triplicates using the Cell proliferation kit II, which is based on colorimetric change of the yellow tetrazolium salt 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl]-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt in orange formazan dye by the respiratory chain of viable cell.

• Modelli animali

  SCID mice bearing ES-1, BE, or PC3 xenografts that express IGF-1R, or R- v-src (IGF-1R negative) and P12 (overexpressing IGF-1 and IGF-1R)

• Dosaggi

  20 mg/kg/12 h

• Somministrazione

  i.p.