PHA-767491 HCl

PHA-767491 mostra una selettività di circa 20 volte per Cdk1, Cdk2 e GSK3-β, una selettività di 50 volte per MK2 e Cdk5 e una selettività di 100 volte per PLK1 e CHK2. PHA-767491 inibisce la proliferazione cellulare in una varietà di linee cellulari umane con IC50 da 0,86 μM per SF-268 a 5,87 μM per K562, e induce significativamente l'apoptosi in modo p53-indipendente in quasi tutte le linee cellulari, in contrasto con il 5-FU che funziona solo in alcune linee cellulari. A differenza degli attuali inibitori della sintesi del DNA, il trattamento con PHA-767491 a 5 μM blocca l'inizio della replicazione del DNA ma non la progressione della forcella di replicazione, a causa della specifica inibizione della chinasi Cdc7 e della fosforilazione di Mcm2 nel sito Ser40 dipendente da Cdc7. [1] I livelli di Mcl-1 sovraregolati nelle cellule OCI-LY1 e SU-DHL-4 resistenti ad ABT-737 possono essere significativamente diminuiti dal trattamento con PHA-767491 a 3 μM, probabilmente a causa dell'inibizione di Cdk9, portando al ripristino della sensibilità ad ABT-737. [2] L'effetto pro-apoptosi diretto dipendente dai mitocondri di PHA-767491 si osserva anche quando applicato a 1 μM nelle cellule di leucemia linfatica cronica (CLL) quiescenti attraverso un meccanismo simile con EC50 di 0,34-0,97 μM. Nelle cellule CLL proliferanti stimolate da CD154 e interleuchina-4, il trattamento con PHA-767491 a 5 μM abolisce la sintesi del DNA inibendo Cdc7 piuttosto che innescando la morte cellulare. [3]

L'amministrazione di PHA-767491 due volte al giorno per 5 giorni inibisce significativamente la crescita di xenotrapianti HL60 in modo dose-dipendente con un TGI del 50% e del 92% a dosi di 20 mg/kg e 30 mg/kg, rispettivamente, il cui effetto è marcato anche nei modelli di xenotrapianto A2780, Mx-1 e HCT-116, nonché nei carcinomi mammari, e correla con l'inibizione di Cdc7 e la successiva diminuzione della fosforilazione di Mcm2 nel sito Ser40 dipendente da Cdc7 [1]

• Saggi chinasici in vitro

  L'inibizione di Cdc7 e CDK9 da parte di PHA-767491 (IC50) è determinata utilizzando il saggio basato sullo scambiatore anionico forte (resina Dowex 1-X8, forma formato). Per ogni enzima, vengono inizialmente determinati i valori assoluti di K_m per l'ATP e il substrato specifico, e ogni saggio viene quindi eseguito a concentrazioni ottimizzate di ATP/³³P-γ-ATP mix (2K_m) e substrato (5K_m). Il saggio della chinasi Cdc7 viene eseguito in un tampone contenente 50 mM Hepes pH 7,9, 15 mM MgCl₂, 2 mM β-glicerofosfato, 0,2 mg/mL BSA, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP mix, 5K_m Mcm2 (aa 10-294), 37 nM di Cdc7/Dbf4 ricombinante e concentrazione crescente di PHA-767491 in un volume finale di 30 μL, e incubato per 1 ora a 25 °C. Il saggio della chinasi CDK9 viene eseguito utilizzando 50 nM di Cdk9/ciclina T ricombinante in 50 mM HEPES pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 3 μM Na₃VO₄, 2K_m ATP/³³P-γ-ATP mix, 5K_m peptide CDT della RNA polimerasi e concentrazione crescente di PHA-767491 in un volume finale di 30 μL, e incubato per 1 ora a 25 °C. Dopo l'incubazione, viene aggiunta una quantità di 150 μL di resina/formiato (pH 3,0) per interrompere la reazione e catturare l'³³P-γ-ATP non reagito, separandolo dal substrato fosforilato in soluzione. Dopo 1 ora di riposo, un volume di 50 μL di surnatante viene trasferito in piastre Optiplate a 96 pozzetti. Dopo l'aggiunta di 150 μL di Microscint 40, la radioattività viene contata nel TopCount.

• Linee cellulari

  HeLa, MCF7, HCT-116, U2OS, A2780, K562, SF-539, SF-268, Ovcar8, SW480, COLO205, HCT-15, Jurkat, PC3, and NHDF

• Concentrazioni

  Dissolved in DMSO, final concentrations ~ 20 μM

• Tempo di incubazione

  24 or 72 hours

• Metodo

  Cells are exposed to PHA-767491 for 24 or 72 hours. Cells are lysed and the ATP content in the well, used as a measure of viable cells, is determined using a thermostable firefly luciferase–based assay. Activation of caspase-3 and caspase-7 is measured as a ratio between treated sample and untreated control with a luciferase-based assay, containing a specific proluminescent substrate. DNA replication is measured as incorporation of nucleotide analog BrdU into DNA by flow cytometry.

• Modelli animali

  Female SCID mice subcutaneously implanted with HL60 cells, male Hsd, athymic nu-nu mice subcutaneously implanted with HCT116 cells, A2780 or Mx-1 cells, and female Sprague-Dawley rats with mammary carcinomas

• Dosaggi

  ~50 mg/kg

• Somministrazione

  Intravenous or oral administration twice a day