Dacomitinib

PF299804 è un inibitore specifico della famiglia di chinasi ERBB. Questo composto inibisce la segnalazione di EGFR e induce l'apoptosi nella linea cellulare H3255 GR contenente EGFR T790M. È efficace nelle linee cellulari di NSCLC sensibili e non. Questa sostanza chimica inibisce la crescita delle cellule H3255 e HCC827 ingegnerizzate per esprimere EGFR T790M. Inibisce la fosforilazione di EGFR in presenza della mutazione T790M. [1] Si ritiene che questo agente inibisca irreversibilmente l'attività della tirosina chinasi ERBB legandosi al sito ATP e modificando covalentemente i residui di cisteina nucleofili nei domini catalitici dei membri della famiglia ERBB. [2] Mostra effetti significativi di inibizione della crescita nelle cellule di cancro gastrico amplificate per HER2 (SNU216, N87) e ha valori di concentrazione inibitoria del 50% inferiori rispetto ad altri inibitori della tirosina chinasi di EGFR, inclusi BIBW-2992 e CI-1033. Questo inibitore induce l'apoptosi e l'arresto in G1 e inibisce la fosforilazione dei recettori della famiglia HER e delle vie di segnalazione a valle, inclusi STAT3, AKT e le chinasi regolate da segnali extracellulari (ERK) nelle cellule di cancro gastrico amplificate per HER2. Blocca anche la formazione di eterodimeri EGFR/HER2, HER2/HER3 e HER3/HER4, nonché l'associazione di HER3 con p85 α nelle cellule SNU216. [3] Una ricerca recente utilizza quarantasette linee cellulari di cancro al seno umano e di cellule epiteliali mammarie immortalizzate per valutare gli effetti di inibizione di questo composto; i risultati indicano che inibisce preferenzialmente la crescita delle linee cellulari di cancro al seno amplificate per HER-2 rispetto alle linee non amplificate (RR = 3,39, p < 0,0001). Questa sostanza chimica riduce la fosforilazione di HER2, EGFR, HER4, AKT ed ERK nella maggior parte delle linee sensibili. Esercita il suo effetto antiproliferativo attraverso un arresto combinato in G0/G1 e un'induzione dell'apoptosi. [4]

Il PF299804 somministrato per via orale inibisce efficacemente la crescita degli xenotrapianti HCC827 Del/T790M. [1] Una bassa somministrazione orale di questo composto (15 mg/kg) provoca una significativa attività antitumorale, incluse marcate regressioni tumorali in una varietà di modelli di xenotrapianto tumorali umani che esprimono e/o sovraesprimono i membri della famiglia ERBB o contengono la doppia mutazione (L858R/T790M) in ERBB1 (EGFR). [2]

• Saggio di chinasi ERBB basato su ELISA

  Le proteine di fusione citoplasmatiche ERBB1, ERBB2 ed ERBB4 sono prodotte clonando la sequenza ERBB1 (Met-668 a Ala-1211), ERBB2 (Ile-675 a Val-1256) ed ERBB4 (Gly-259 a Gly-690) nel vettore baculovirale pFastBac usando la PCR. Le proteine sono espresse in cellule di insetto Sf9 infettate da baculovirus come proteine di fusione GST. Le proteine sono purificate mediante cromatografia di affinità usando sfere di sefarosio al glutatione. L'inibizione dell'attività della tirosina chinasi ERBB viene valutata utilizzando un saggio di tirosina chinasi recettoriale basato su ELISA. Le reazioni chinasiche (50 mM HEPES, pH 7,4, 125 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 100 μM ortovanadato di sodio, 2 mM ditiotreitolo, 20 μM ATP, questo composto o controllo veicolo, e 1-5 nM GST-erbB per 50 μL di miscela di reazione) vengono eseguite in piastre a 96 pozzetti rivestite con 0,25 mg/mL di poli-Glu-Tyr. Le reazioni vengono incubate per 6 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione. Le reazioni chinasiche vengono interrotte rimuovendo la miscela di reazione, quindi i pozzetti vengono lavati con tampone di lavaggio (0,1% Tween 20 in PBS). I residui di tirosina fosforilati vengono rilevati aggiungendo 0,2 μg/mL di anticorpo anti-fosfotirosina (Oncogene Ab-4; 50 μL/pozzetto) accoppiato a perossidasi di rafano (HRP) diluito in PBS contenente 3% BSA e 0,05% Tween 20 per 25 minuti sotto agitazione a temperatura ambiente. L'anticorpo viene rimosso e le piastre vengono lavate in tampone di lavaggio. Il substrato HRP (SureBlue3,3 ,5,5-tetrametil benzidina o TMB) viene aggiunto (50 μL per pozzetto) e incubato per 10-20 minuti sotto agitazione a temperatura ambiente. La reazione TMB viene interrotta con l'aggiunta di 50 μL di soluzione di arresto (0,09 N H₂SO₄). Il segnale viene quantificato misurando l'assorbanza a 450 nm. I valori di IC50 vengono determinati per questo composto utilizzando il metodo dell'effetto mediano.

• Linee cellulari

  Various NSCLC cell lines

• Concentrazioni

  0-20 nM

• Tempo di incubazione

  72 hours

• Metodo

  Growth and inhibition of growth is assessed by 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay. This assay, a colorimetric method fordetermining the number of viable cells, is based on the bioreduction of MTS by cells to a formazan product that is soluble in cell culture medium, can be detected spectrophotometrically. The cells are exposed totreatment for 72 hours, and the number of cells used per experiment is determined empirically. All experimental points are set up in 6 to 12 wells, and all experiments are repeated at least thrice. The data are graphically displayed using GraphPad Prism version 3.00 for Windows (GraphPad Software). The curves are fitted using a nonlinear regression model with a sigmoidal dose response.

• Modelli animali

  HCC827-GFP or HCC827-Del/T790M lung cancer cells (in 0.2 mL of PBS) are inoculated s.c. into the lower-right quadrant of the flank of nude mice

• Dosaggi

  10 mg/kg

• Somministrazione

  Administered via oral gavage