In vivo (Aggiungere i solventi al prodotto singolarmente e in ordine.)
Homogeneous suspension
CMC-NA
≥5mg/ml
Taking the 1 mL working solution as an example, add 5 mg of this product to 1 ml of CMC-Na solution, mix evenly to obtain a homogeneous suspension with a final concentration of 5 mg/ml.
* <1 mg/ml significa leggermente solubile o insolubile. * Si prega di notare che Selleck testa la solubilità di tutti i composti internamente e la solubilità effettiva può differire leggermente dai valori pubblicati. Ciò è normale ed è dovuto a leggere variazioni da lotto a lotto. * Spedizione a temperatura ambiente (I test di stabilità mostrano che questo prodotto può essere spedito senza alcuna misura di raffreddamento.)
Preparazione delle soluzioni stock
Attività biologica
Descrizione
PF-5274857 è un antagonista potente e selettivo della Smoothened (Smo), inibisce la segnalazione Hedgehog (Hh) con IC50 e Ki di 5,8 nM e 4,6 nM, rispettivamente, e questo composto può penetrare la barriera emato-encefalica.
Target
Smoothened
Smoothened
4.6 nM(Ki)
5.8 nM
In vitro
PF-5274857 inibisce completamente l'attività della via Hh indotta da Shh con un IC50 di 2,7 nM, misurato dall'attività trascrizionale del gene Gli1 a valle di Smo nelle cellule MEF. Il recettore μ-oppioide è debolmente inibito da questo composto con una costante di dissociazione di 36 μM determinata successivamente in un saggio funzionale.
In vivo
PF-5274857 mostra una significativa inibizione dose-dipendente della crescita tumorale (TGI) e induce la regressione tumorale a dosi elevate (>10 mg/kg). Questo composto downregola i livelli di espressione genica di Gli1, Gli2, Ptch1 e Ptch2 a vari gradi, con effetti massimi raggiunti tra 6 e 12 ore post-dose (Gli1 è il gene più sensibile), mentre ha scarso effetto sui livelli di Smo. Nel tessuto cutaneo, la downregolazione di Gli1 e Gli2 è anche osservata con un simile andamento temporale da questa sostanza chimica. La concentrazione del farmaco derivata dal modello per l'inibizione semimassimale del tasso di produzione di mRNA di Gli1 tumorale (IC50) da parte di questo composto è determinata essere di 8,9 nM nei topi allograft di medulloblastoma Ptch+/−p53+/−, il che corrisponde matematicamente a una regressione tumorale del 119% di TGI dopo 6 giorni di esposizione plasmatica a questa concentrazione. Nei topi allograft di medulloblastoma Ptch+/−p53−/−, il valore di IC50 è stimato essere di 3,5 nM, coerente con i risultati di Ptch+/−p53+/−. È anche in grado di attraversare la barriera emato-encefalica nei ratti entro 4 ore post-dose.
Le cellule HEK293 che sovraesprimono Smo umana (aminoacidi 181-787) vengono coltivate in Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM) supplementato con 10% di FBS, Pen-Strep e 0,1 mg/mL di igromicina fino al 90% di confluenza. Dopo il lavaggio con PBS freddo di Dulbecco, il pellet cellulare viene risospeso in tampone di preparazione della membrana (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM saccarosio con cocktail completo di proteasi Roche) e omogeneizzato. L'omogenato viene centrifugato e il pellet cellulare viene risospeso in tampone di saggio (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 1 mM EDTA e 0,1% di albumina sierica bovina priva di proteasi) e omogeneizzato in un omogeneizzatore di vetro. La proteina totale nella preparazione di membrana contenente Smo viene determinata utilizzando il saggio proteico Pierce BCA. Per il saggio di legame competitivo, 100 μL di tampone di saggio vengono aggiunti a una piastra filtrante GF/B a 96 pozzetti per 10 minuti per pre-inumidire il filtro e quindi rimossi. Vengono quindi aggiunti i seguenti reagenti: 20 μL di tampone di saggio, 10 μL di diluizioni seriali di questo composto, 20 μL di antagonista 3H-Smo (concentrazione finale di 3 nM) e 50 μL di preparazione di membrana (40 μg di proteina totale). Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente per 2 ore, quindi lavate e asciugate sotto vuoto. Le piastre vengono quindi asciugate per 1 ora in un forno a 60°C prima dell'aggiunta di 45 μL di Microscint 20 e incubate a temperatura ambiente per 30 minuti a 1 ora, quindi contate in un contatore a scintillazione TopCount. I dati vengono analizzati utilizzando il software GraphPad Prism.
Gli-Luc/MEF cells are grown in the knockout DMEM supplemented with 10% heat-inactive FBS, 2 mM l-glutamine, and 0.55 mM β-mercaptoethanol until 90% confluence. On day 1, cells are trypsinized and seeded into white 384-well plates in 20 μL per well of OptiMEM media that is supplemented with 1% heat-inactive FBS and 1 mM sodium pyruvate at a concentration of 7,500 cells per well. Plates are incubated at 37 °C and 5% CO2 overnight. On day 2, this compound is added to the cells at a final concentration ranging from 3 μM to 50 pM at a 3-fold serial dilution followed by addition of recombinant mouse Sonic Hedgehog to a final concentration of 2 μg/mL. The cells are incubated with this chemical and Shh for 48 hours at 37 °C and 5% CO2. Luciferase assays are conducted on day 4 using the Bright-Glo Luciferase Assay System. Briefly, Bright-Glo luciferase reagent (25 μL) is added to each well of the 384-well plate containing media. Plates are kept at room temperature for 5 minutes and then read on a Luminescence plate reader. The IC50 value of this compound is calculated.
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