Ozanimod

Nelle cellule S1P1R-HEK293T, Ozanimod induce un'internalizzazione e degradazione sostenute di S1P1R. [1]

In vivo, Ozanimod mostra un'elevata biodisponibilità orale e volume di distribuzione. In un modello murino di EAE indotta da MOG, questo composto (3 mg/kg, p.o.) sopprime i sintomi clinici. In un modello di ratto TNBS di malattia infiammatoria intestinale, (1,2 mg/kg, p.o.) inibisce i punteggi clinici e istologici della malattia. In un modello di trasferimento adottivo di cellule T CD4+CD45Rbhi naïve, questa sostanza chimica (1,2 mg/kg, p.o.) ha anche ridotto significativamente la gravità della malattia, come valutato misurando il grado di infiammazione, perdita ghiandolare, iperplasia, infiltrato neutrofilo e spessore della mucosa. [1]

• Saggi di farmacologia in vitro

  I saggi di segnalazione cellulare hanno utilizzato il saggio LiveBLAzer-FRET B/G per rilevare il cAMP (S1P1R) o la segnalazione di β-arrestina (S1P4R). I saggi vengono eseguiti in piastre a 384 pozzetti in triplicato secondo le istruzioni del produttore. I campioni dei composti vengono conservati a 10 mM in 100% DMSO a -80°C e inizialmente diluiti 1:10 con il 20% di (2-idrossipropil)-β-ciclodestrina. Viene generata una curva dose-risposta a 10 punti a 40 volte la concentrazione finale del saggio in 10 mM Hepes pH 7,4, contenente 0,1% Pluronic F-127. Per il saggio S1P1R, 80 μM di forskolina sono inclusi nel diluente. In breve, 10⁴ cellule/pozzetto vengono incubate con una dose-risposta del ligando a 37°C per 4 ore. Il substrato CC4-AM e il probenecid vengono aggiunti e incubati a 37°C per altre 2 ore e analizzati con uno SpectramaxM5. Per i saggi cAMP S1P1R, i dati vengono normalizzati alla massima fluorescenza generata da 2 μM di forskolina. Per i saggi di legame GTPγS, 1-5 μg/pozzetto di proteina di membrana vengono incubati con 10 μM di GDP, 100-500 μg/pozzetto di perline SPA PVT di agglutinina di germe di grano in 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 20 μg/ml di saponina e 0,1% di BSA privo di acidi grassi per 15 minuti in piastre a 96 pozzetti. Dopo l'aggiunta del composto e 200 pM di GTP [35S] (1250 Ci/mmol), le piastre vengono incubate per 120 minuti e centrifugate a 300 g per 5 minuti. La radioattività viene rilevata con uno strumento TopCount. Tutti i dati vengono adattati con una regressione non lineare a quattro parametri a pendenza variabile (GraphPad Prism) per generare la concentrazione efficace massima (EC50) e l'efficacia massima relativa a S1P.

• Linee cellulari

  HEK293T cells

• Concentrazioni

  1 μM

• Tempo di incubazione

  1 h

• Metodo

  Cells expressing S1P1 receptors were incubated with vehicle control or 1 μM this compound for 1 h.

• Modelli animali

  MOG-induced EAE model in C57Bl6 mice, TNBS model of inflammatory bowel disease in male Sprague Dawley rats, and Na飗e CD4+CD45Rbhi T cell adoptive transfer model in SCID mice

• Dosaggi

  0.1-3 mg/kg

• Somministrazione

  p.o.