AZD2281 (Olaparib)

Olaparib (AZD2281) agirebbe contro le mutazioni BRCA1 o BRCA2 e non è sensibile alla tankyrase-1 (IC50 >1 μM). Potrebbe annullare l'attività di PARP-1 a concentrazioni di 30-100 nM nelle cellule SW620. Questo composto è ipersensibile alle linee cellulari deficienti in BRCA1 (MDA-MB-463 e HCC1937), rispetto alle linee cellulari competenti in BRCA1 e BRCA2 (Hs578T, MDA-MB-231 e T47D). [1] È fortemente sensibile alle cellule KB2P a causa della soppressione della riparazione per escissione di base da parte dell'inibizione di PARP, che può comportare la conversione di rotture a singolo filamento in rotture a doppio filamento durante la replicazione del DNA, attivando così le vie di ricombinazione dipendenti da BRCA2. [2]

Olaparib (AZD2281) (10 mg/kg, p.o.) in combinazione sopprime significativamente la crescita tumorale negli xenotrapianti SW620. [1] Mostra un'ottima risposta ai tumori mammari Brca1^-/-;p53^-/- (50 mg/kg i.p. al giorno), mentre nessuna risposta ai tumori mammari Ecad^-/-;p53^-/- deficienti in HR. Questo composto non mostra nemmeno tossicità dose-limitante nei topi portatori di tumore. [3] È stato utilizzato per trattare tumori con mutazioni BRCA, come i tumori ovarici, mammari e prostatici. Inoltre, mostra un'inibizione selettiva delle cellule tumorali deficienti in ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated), il che indica che potrebbe essere un potenziale agente per il trattamento dei tumori linfoidi mutanti ATM. [4]

• Saggio FlashPlate (saggio di screening a 96 pozzetti)

  Nelle colonne da 1 a 10, viene aggiunto 1 μL di Olaparib (AZD2281) (in DMSO), e solo 1 μL di DMSO viene aggiunto ai pozzetti di controllo positivo (POS) e negativo (NEG) (rispettivamente colonne 11 e 12) di una FlashPlate pretrattata. PARP-1 viene diluita 1:40 in tampone (tampone B: 10% glicerolo (v/v), 25 mM HEPES, 12,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,01% NP-40 (v/v), pH 7,6) e 40 μL vengono aggiunti a tutti i 96 pozzetti (la concentrazione finale di PARP-1 nel saggio è di circa 1 ng/μL). La piastra viene sigillata e agitata a temperatura ambiente per 15 min. Successivamente, 10 μL di miscela di reazione positiva (0,2 ng/μL di oligonucleotidi a doppio filamento [M3/M4] DNA per pozzetto, 5 μM di concentrazione finale di NAD⁺ nel saggio e 0,075 μCi di ³H-NAD⁺ per pozzetto) vengono aggiunti ai pozzetti appropriati (colonne 1-11). La miscela di reazione negativa, priva dell'oligonucleotide DNA, viene aggiunta alla colonna 12 (con il valore medio del controllo negativo utilizzato come background). La piastra viene nuovamente sigillata e agitata per altri 60 min a temperatura ambiente per consentire alla reazione di continuare. Quindi, 50 μL di acido acetico ghiacciato (30%) vengono aggiunti a ciascun pozzetto per arrestare la reazione, e la piastra viene sigillata e agitata per altri 60 min a temperatura ambiente. Il segnale tritiato legato alla FlashPlate viene quindi determinato in conteggi per minuto (CPM) utilizzando il lettore di piastre TopCount.

• Linee cellulari

  Breast cancer cell lines including SW620 colon, A2780 ovarian, HCC1937, Hs578T, MDA-MB-231, MDA-MB-436, and T47D

• Concentrazioni

  1-300 nM

• Tempo di incubazione

  7-14 days

• Metodo

  The cytotoxicity of Olaparib (AZD2281) is measured by clonogenic assay. It is dissolved in DMSO and diluted by culture media before use. The cells are seeded in six well plates and left to attach overnight. Then this compound is added at various concentrations and the cells are incubated for 7-14 days. After that the surviving colonies are counted for calculating the IC50.

• Modelli animali

  Brca1^-/-;p53^-/- mammary tumors are generated in K14cre;Brca1^F/F;p53^F/F mice.

• Dosaggi

  50 mg/kg

• Somministrazione

  Administered via i.p. injection at 10 μL/g of body weight