BIBF 1120 (Nintedanib)

BIBF1120 inibisce l'attività chinasica di PDGFR dei tipi PDGFR alfa e PDGFR beta con valori di IC50 di 59 nM e 65 nM, rispettivamente. Inoltre, BIBF1120 sopprime i sottotipi di FGFR con IC50 di 60 nM, 37 nM e 108 nM per FGFR1, FGFR2 e FGFR3, rispettivamente. BIBF1120 si lega al sito di legame dell'ATP nella fessura tra i lobi ammino e carbossi-terminali del dominio chinasico. Lo scaffold indolinone forma due legami idrogeno con l'azoto dello scheletro di Cys⁹¹⁹ e l'ossigeno carbonilico dello scheletro di Glu⁹¹⁷ nella regione del cerniera. BIBF 1120 inibisce la proliferazione delle BRP stimolate da PDGF-BB con una EC50 di 79 nM in saggi cellulari. BIBF1120 a concentrazioni fino a 100 nM blocca l'attivazione di MAPK dopo stimolazione con 5% di siero più PDGF-BB. In colture di cellule muscolari lisce vascolari umane (HUASMC), BIBF1120 previene la proliferazione stimolata da PDGF-BB con una EC50 di 69 nM. [1]

In tutti i modelli tumorali testati finora, inclusi xenotrapianti tumorali umani cresciuti in topi nudi e un modello di tumore di ratto singenico, BIBF1120 è altamente attivo a dosi ben tollerate (25-100 mg/kg al giorno p.o.). Ciò è evidente nell'imaging a risonanza magnetica della perfusione tumorale dopo 3 giorni, riducendo la densità e l'integrità vascolare dopo 5 giorni, e una profonda inibizione della crescita. [1]

• Saggio chinasi VEGFR2

  Il dominio tirosina chinasico citoplasmatico di VEGFR2 (residui 797-1355 secondo la sequenza depositata nella banca dati SWISS-PROT P35968) viene clonato in pFastBac fuso a GST ed estratto. L'attività enzimatica viene saggiata in presenza o assenza di diluizioni seriali di BIBF1120 eseguite in DMSO al 25%. Ogni piastra per microtitolazione contiene controlli interni come il bianco, la reazione massima e il composto di riferimento storico. Tutte le incubazioni vengono condotte a temperatura ambiente su uno shaker rotante. 10 μL di ogni diluizione di BIBF1120 vengono aggiunti a 10 μL di chinasi diluita (0,8 μg/mL VEGFR2, 10 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA e 2 mg/mL BSA) e preincubati per 1 ora. La reazione viene avviata aggiungendo 30 μL di miscela di substrato contenente 62,4 mM Tris pH 7,5, 2,7 mM DTT, 5,3 mM MnCl₂, 13,3 mM Mg-acetato, 0,42 mM ATP, 0,83 mg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1) e 1,7 μg/mL Poly-Glu-Tyr(4:1)-biotina e incubata per 1 ora. La reazione viene arrestata aggiungendo 50 μL di 250 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,4. 90 μL della miscela di reazione vengono trasferiti su una piastra di streptavidina e incubati per 1-2 ore. Dopo tre lavaggi con PBS, viene aggiunto l'anticorpo marcato con EU, PY20 (diluizione raccomandata 1:2000 di 0,5 mg/mL di anticorpo marcato in tampone di saggio DELFIA). L'eccesso di anticorpo di rilevazione viene rimosso con tre lavaggi di tampone di lavaggio DELFIA. Quindi, 10 minuti prima della misurazione sul lettore multilabel, ogni pozzetto viene incubato con 100 μL di soluzione di potenziamento DELFIA.

• Linee cellulari

  HUVEC, HUASMC, and BRP cell lines

• Concentrazioni

  50 nM

• Tempo di incubazione

  2 hours

• Metodo

  The cell lines HUVEC, HUASMC, and BRP are used for the assay. BIBF1120 is added to the cultures two hours before the addition of ligands. Cell lysates are generated. Western blotting is done using standard SDS-PAGE methods, loading 50 to 75 μg of protein per lane. Detection is facilitated by enhanced chemiluminescence. Total and phosphorylated mitogen-activated protein kinase (MAPK) is analyzed using monoclonal antibodies M3807 and M8159. Total Akt is detected using the corresponding polyclonal antibody and phosphorylated Akt (Ser473) is analyzed by using its monoclonal antibody. Monoclonal antibody is also used to detect cleaved caspase-3 while KDR (VEGFR2) protein is detected using a corresponding antibody.

• Modelli animali

  FaDu, Caki-1, SKOV-3, H460, HT-29, or PAC-120 xenografts in Athymic NMRI-nu/nu female mice

• Dosaggi

  100 mg/kg

• Somministrazione

  p.o.